DHE 活性氧荧光探针（红色），可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的 ROS 氧化，形成氧化乙锭；氧化乙锭可掺入染色体 DNA 中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞 ROS 含量的多少和变化。DHE 活性氧荧光探针（红色） 在细胞内主要被超氧阴离子型 ROS 氧化，用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中 ROS 经典检测方法。

一、核心优势：O??特异性响应与高精准度

O??介导的特异性荧光激活，无交叉干扰

DHE 为脂溶性非荧光前体（分子量≈314 Da），可自由穿透活细胞膜及线粒体膜；进入细胞后，仅被超氧阴离子（O??）氧化生成红色荧光产物 ** ethidium（Eth，激发 / 发射≈518/605 nm）**，Eth 可嵌入 DNA，产生稳定的红色荧光。

对其他 ROS（如 H?O?、?OH）、活性氮（RNS）响应极低（氧化效率仅为 O??的 1/20 以下），无需加入其他抑制剂（如 CAT 清除 H?O?），检测特异性达 95% 以上，远超广谱 ROS 探针（如 DCFH-DA，易受多种 ROS 干扰）。

可区分 O??来源：因能穿透线粒体膜，可特异性检测线粒体呼吸链产生的 O??（细胞内 O??的主要来源），也可检测胞质中 NADPH 氧化酶产生的 O??，适配不同部位 O??的研究需求。

高灵敏度，捕捉低浓度 O??动态

氧化后荧光增强倍数超 100 倍（Eth 量子产率≈0.15，嵌入 DNA 后荧光进一步增强），检测限低至 5 nM（针对 O??），可捕捉细胞静息态（10-20 nM）与激活态（50-100 nM）O??的细微波动（如线粒体抑制剂处理后 O??浓度的 3 倍升高）。

低工作浓度（1-5 μM）即可满足检测需求，避免高浓度探针引发的非特异性氧化，适合敏感样本（如神经元、心肌细胞）的长期监测。

二、红色荧光的独特优势：低背景与深层成像

极低生物背景，信噪比突破新高

红色荧光（605 nm 发射）远离细胞自发荧光的主要波段（蓝色 / 绿色，发射峰＜550 nm），生物组织（如细胞、组织切片）对其自发荧光贡献仅为绿色探针的 1/50 以下，在复杂样本（如肿瘤类器官、小鼠组织切片）中，信噪比可达 35:1 以上，远超 DCFH-DA（约 25:1）。

不与血红蛋白、胆红素等生物分子发生显著吸收（这些分子对可见光吸收强，对红色光吸收弱），避免血液丰富组织（如肝脏、心脏）中的样本自身成分干扰，尤其适合活体或组织水平的 O??检测。

深层组织穿透，适配复杂样本成像

红色光在生物组织中的散射和吸收是所有荧光波段中较低的，穿透深度可达 60-100 μm（绿色探针约 20-30 μm），可穿透 3D 细胞球、类器官核心区域或小鼠薄组织切片（如皮肤、肌肉切片），清晰观察深层细胞的 O??分布，无需解剖或过度切片即可获取完整信号。

三、活细胞兼容性与操作优势

低毒性，不干扰 O??生成与细胞功能

工作浓度（1-5 μM）下，对细胞活性、线粒体呼吸链功能（如 ATP 生成）及 O??产生相关酶（如 NADPH 氧化酶、线粒体复合物 I）活性无显著影响：

心肌细胞：标记后收缩频率正常，线粒体 O??生成速率与未标记组一致，可长期观察（＞24 小时）缺血再灌注过程中 O??的动态变化；

神经元：不影响突触传递功能，可准确检测神经炎症状态下的 O??升高，避免探针自身对神经功能的干扰。

操作简便，适配多检测平台

染色流程简单：直接加入培养基或缓冲液（如 PBS、HBSS），37℃孵育 15-30 分钟即可，无需透膜（脂溶性助其跨膜）、洗涤（少量胞外游离探针不影响信号），比免疫荧光标记节省 2-3 小时；

兼容多种检测手段：

荧光显微镜 / 共聚焦：观察 O??在细胞内的空间分布（如线粒体区域红色荧光更强，提示 O??主要产生于线粒体）；

流式细胞术：定量细胞群中 O??阳性细胞比例（如炎症刺激后阳性率从 12% 升至 65%）；

活体成像：标记小鼠后肢肌肉，观察运动后肌肉组织中 O??的荧光变化，实时评估氧化应激水平。

四、典型应用场景

线粒体功能与 O??关联研究

线粒体抑制剂实验：用鱼藤酮（抑制线粒体复合物 I）处理细胞，DHE 荧光在 30 分钟后显著增强（线粒体 O??堆积），共聚焦成像显示线粒体区域红色荧光聚集，证明线粒体呼吸链损伤会导致 O??过量产生；

神经退行性疾病模型：在帕金森病小鼠多巴胺神经元中，DHE 荧光强度比正常小鼠高 2.8 倍，且与 α- 突触核蛋白聚集区域重叠，提示 O??过量与疾病病理进程相关。

炎症与氧化应激研究

巨噬细胞活化：LPS 刺激巨噬细胞，DHE 通过流式细胞术检测到 O??阳性细胞比例从 10% 升至 70%，同时伴随 IL-1β 炎症因子升高，关联 O??释放与炎症反应的因果关系；

缺血再灌注损伤：大鼠心肌缺血再灌注模型中，DHE 标记显示再灌注阶段心肌组织 O??荧光骤升（1 小时内达峰值），配合 TTC 染色验证心肌梗死区域，证明 O??过量是缺血再灌注损伤的关键因素。

药物筛选与毒性评估

抗氧化药物筛选：96 孔板培养心肌细胞，加入 DHE 与候选抗氧化剂（如辅酶 Q10 衍生物），再用 H?O?诱导 O??产生，微孔板 reader 检测红色荧光强度，筛选能显著降低荧光的药物，计算抗氧化活性 IC??；

药物毒性检测：化疗药（如顺铂）处理肾小管上皮细胞，DHE 荧光随药物浓度升高而增强，提示药物诱导的 O??过量是肾毒性的重要机制，可通过荧光强度量化毒性等级。

五、技术优化与注意事项

浓度与孵育控制

活细胞标记：1-5 μM 孵育 15-30 分钟，敏感细胞（如神经元、胚胎细胞）建议使用 1-2 μM 低浓度，避免高浓度导致的非特异性氧化；

组织样本：需延长孵育时间至 40-60 分钟，必要时加入 0.02% Pluronic F-127（助探针渗透），确保探针均匀分布至组织深层。

避免光氧化干扰

DHE 自身易被强光氧化生成 Eth，实验全程需避光操作（如避光孵育、暗场成像）；

成像时激光强度控制在 10-20%（543 nm 或 561 nm 激光），减少强光对探针的非特异性激活，避免假阳性信号。

特异性验证

实验需设置阳性对照（如黄嘌呤氧化酶 + 黄嘌呤，诱导 O??产生）与阴性对照（如加入 O??清除剂 SOD，抑制 O??），通过荧光差异验证信号特异性；若需区分线粒体与胞质 O??，可联用线粒体标记探针（如 MitoTracker Green）进行共定位分析。

总结

DHE 凭借 “O??特异性响应 + 红色荧光低干扰 + 全细胞 O??检测 + 低毒性” 的核心优势，突破了广谱 ROS 探针 “特异性低” 与线粒体特异性探针 “检测范围窄” 的局限，可精准捕捉不同来源 O??的动态变化，尤其适合线粒体功能损伤、炎症氧化应激及深层组织 O??监测。相比同类探针，其在特异性、穿透性与应用灵活性上更优，是 O??相关研究的高效工具。

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