DCFH-DA（二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯）本身无荧光，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的酯酶水解，形成 DCFH，DCFH 无荧光且不能通透细胞膜，从而被细胞内的活性氧氧化生成有荧光的 DCF。根据活细胞中荧光的产生，可以判断细胞活性氧的含量和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种经典的组织或活细胞中活性氧检测方法。Rosup 为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。

一、核心优势：广谱 ROS 响应与高灵敏度

覆盖多类 ROS，适配不同氧化应激场景

DCFH-DA 为脂溶性非荧光前体（分子量≈487 Da），可自由穿透活细胞膜；进入细胞后，被胞内酯酶水解为水溶性的 DCFH（无法跨膜扩散），DCFH 可被多种 ROS（如 H?O?、?OH、ONOO?、ROO?）氧化为强绿色荧光产物 DCF（激发 / 发射≈488/525 nm），荧光强度与 ROS 总水平呈正相关。

响应范围广，无需针对特定 ROS 更换探针，可检测生理（如细胞代谢产生的低水平 ROS）与病理（如药物诱导的 ROS 爆发）状态，适配炎症、缺血再灌注损伤、衰老等多种研究场景，实用性远超特异性 ROS 探针（如仅检测线粒体 O??的 MitoSOX Red）。

高灵敏度，捕捉细微 ROS 波动

氧化后荧光增强倍数超 50 倍（DCF 量子产率≈0.7），检测限低至 10 nM（针对 H?O?），可捕捉到静息态→激活态的 ROS 细微变化（如细胞受刺激后 ROS 浓度从 20 nM 升至 100 nM）。

低工作浓度（1-10 μM）即可满足检测需求，避免高浓度探针自身引发氧化应激，确保检测结果反映细胞真实 ROS 水平，适合敏感样本（如干细胞、神经元）。

二、操作与兼容性优势：便捷性与灵活性兼顾

一步染色，无需复杂预处理

试剂盒预混 DCFH-DA、缓冲液等试剂，无需自行配制；实验流程仅 3 步：① 细胞孵育染料（37℃，20-30 分钟）→ ② 刺激处理（如 H?O?、药物诱导）→ ③ 荧光检测，全程 1.5 小时内完成（比传统化学法如 WST-8 法节省 2 小时），大幅提升实验效率。

无需细胞裂解：直接对活细胞检测，避免 ROS 在样本处理中被氧化 / 清除（ROS 半衰期短，易受操作影响），真实反映实时 ROS 水平，而传统比色法需裂解细胞，易导致信号失真。

适配全平台检测，兼容多场景需求

绿色荧光（525 nm 发射）适配所有常规检测设备，无需特殊滤光片：

荧光显微镜 / 共聚焦：观察 ROS 在细胞内的空间分布（如胞质、线粒体附近的 ROS 差异）；

流式细胞术：定量细胞群中 ROS 阳性细胞比例（如药物处理后 ROS 高表达细胞从 10% 升至 60%）；

微孔板 reader：高通量筛选（如 96/384 孔板药物对 ROS 的调控作用），1 天内可完成上千样本检测。

与其他荧光探针联用无串扰：绿色荧光与红色（如 MitoBright CMXRos）、蓝色（如 DAPI）探针光谱分离度高，可同步检测 ROS 与线粒体功能、细胞核状态（如 “DCFH-DA+MitoTracker Red+DAPI” 联用，分析 ROS 与线粒体损伤的关联）。

三、活细胞兼容性与应用优势

低毒性，不干扰细胞功能与氧化稳态

工作浓度（1-10 μM）下，对细胞活性、增殖及抗氧化系统（如 SOD、GSH-Px 活性）无显著影响：

神经元：标记后轴突生长、突触传递正常，可长期观察（＞24 小时）ROS 动态变化，无细胞凋亡；

肿瘤细胞：不影响细胞周期与药物敏感性，可准确检测化疗药诱导的 ROS 依赖性凋亡。

无 ROS 诱导效应：低浓度下探针自身 ROS 生成量＜5%，避免因标记导致的氧化应激干扰，检测结果更可靠。

适配多样本类型，应用场景广泛

覆盖贴壁细胞（如 HeLa、HUVEC）、悬浮细胞（如免疫细胞、血细胞）、3D 细胞球（如肿瘤类器官、胰岛类器官）及薄组织切片（如小鼠肝脏、皮肤切片）：

3D 样本仅需延长孵育时间至 40 分钟（或加入 0.02% Pluronic F-127 助渗透），即可使探针均匀分布至内部细胞，检测深层细胞的 ROS 水平，这是传统平面细胞模型无法实现的。

四、典型应用场景

氧化应激与细胞凋亡研究

药物诱导凋亡机制：用化疗药（如阿霉素）处理肿瘤细胞，DCFH-DA 检测显示 2 小时后 ROS 荧光强度升高 2.5 倍，4 小时后 Annexin V 阳性率上升，证明 ROS 是药物诱导凋亡的上游信号，可通过 ROS 变化预测凋亡进程。

缺血再灌注损伤：标记心肌细胞，模拟缺血（缺氧）→再灌注（复氧）过程，再灌注阶段 ROS 荧光强度骤升（30 分钟内达峰值），配合线粒体探针观察到 ROS 升高伴随线粒体碎片化，揭示损伤机制。

药物筛选与毒性评估

抗氧化药物筛?。?6 孔板培养细胞，加入 DCFH-DA 与候选抗氧化剂（如维生素 E 衍生物），再用 H?O?诱导 ROS，微孔板 reader 检测荧光强度，筛选能显著降低荧光的药物，计算抗氧化活性 IC??，1 天内完成 384 孔板筛选。

环境毒素毒性检测：检测重金属（Pb2?、Hg2?）、农药残留对肝细胞的毒性 —— 毒素处理后 ROS 荧光随浓度升高而增强，可建立 “浓度 - ROS 水平” 剂量效应关系，量化毒性等级，比传统细胞活力检测更灵敏（提前 2-4 小时发现毒性）。

炎症与衰老研究

炎症细胞 ROS 释放：用 LPS 刺激巨噬细胞，DCFH-DA 通过流式细胞术检测到 ROS 阳性细胞比例从 8% 升至 70%，同时伴随 IL-6 等炎症因子升高，关联 ROS 与炎症反应的因果关系。

细胞衰老 ROS 变化：标记衰老成纤维细胞（β- 半乳糖苷酶阳性），ROS 荧光强度比年轻细胞高 1.8 倍，证明衰老细胞存在 “氧化应激加剧” 特征，可通过 ROS 水平评估细胞衰老程度。

五、技术优化与注意事项

试剂与孵育控制

染料储存：试剂盒需避光 - 20℃保存，稀释后的 DCFH-DA 需现配现用（DMSO 溶液易降解），避免反复冻融；

孵育条件：37℃、5% CO?孵育 20-30 分钟，贴壁细胞轻轻摇晃确保染料均匀，悬浮细胞孵育后无需离心（少量游离探针不影响信号）。

干扰因素排除

避免光漂白：成像时使用抗淬灭培养基（如 ProLong Live），激光强度控制在 10-15%（488 nm 激光），减少强光导致的 DCF 荧光衰减；

排除非 ROS 干扰：若样本含高浓度还原剂（如 GSH），可加入 1mM DTT 中和（不影响 ROS 检测），防止 DCF 被还原导致假阴性；设置阳性对照（H?O?处理）与阴性对照（ROS 清除剂 NAC 处理）验证信号特异性。

定量校准

用 H?O?标准液（0、10、50、100、200 nM）绘制标准曲线：将标准液加入已染色细胞，检测荧光强度，建立 “荧光值 - ROS 浓度” 线性关系，后续通过样本荧光值计算 ROS 绝对浓度，提升数据可比性。

总结

DCFH-DA 活性氧检测试剂盒凭借 “广谱 ROS 响应 + 操作简便 + 高兼容性 + 低毒性” 的核心优势，成为氧化应激研究的 “入门级优选工具”，尤其适合高通量药物筛选、氧化损伤机制研究及常规 ROS 水平检测。相比特异性 ROS 探针，其检测范围更广、适用性更强；相比传统化学法，其操作更快捷、结果更真实，是细胞生物学、药理学、毒理学研究中不可或缺的检测方案。

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