Griess 试剂可用于光度法检测亚硝酸盐。试剂含有两种化学物质，磺胺酸和 N-（1-萘基）乙二胺。在酸性条件下，磺胺酸被亚硝酸盐转化成重氮盐，可与 N-（1-萘基）乙二胺形成高度着色的偶氮染料，可以在 548 nm 检测此染料，由于 NO 极其不稳定，被氧化生成亚硝酸盐和硝酸盐，Griess通过检测亚硝酸盐的含量，间接反映出 NO 的含量。

一、核心优势：NO 特异性响应与高灵敏度

NO 介导的特异性荧光激活，无交叉干扰

试剂盒常用荧光染料（如 DAR-4M AM、DAF-FM DA）为脂溶性前体，可穿透活细胞膜；进入细胞后，仅与 NO（或其活性衍生物如 ONOO?）发生特异性反应 —— 如 DAF-FM DA 与 NO 反应生成荧光产物（激发 / 发射≈495/515 nm），荧光强度与 NO 浓度呈正相关。

对其他活性氧（ROS，如 H?O?、?OH）、活性氮（RNS，如 NO??）无响应，特异性达 98% 以上，无需额外加入抑制剂（如 CAT 清除 H?O?），避免传统 Griess 法中 NO??/NO??转化步骤的干扰，检测结果更精准。

高灵敏度，捕捉低浓度 NO 动态

荧光染料检测限低至 10 nM（Griess 法约 100 nM），可检测细胞静息态 NO（10-50 nM）与激活态 NO（50-500 nM）的细微变化（如炎症因子刺激后 NO 浓度的 2-3 倍升高）。

荧光信号增强倍数超 50 倍（如 DAR-4M AM 反应后荧光量子产率从 0.02 升至 0.6），在低 NO 浓度下仍能产生清晰信号，适合免疫细胞（如巨噬细胞）、内皮细胞等低水平 NO 释放细胞的检测。

二、操作优势：便捷性与兼容性兼顾

一步染色，无需复杂预处理

试剂盒预混染料、缓冲液等试剂，无需自行配制；实验流程仅需 3 步：① 细胞孵育染料（37℃，20-30 分钟）→ ② 刺激处理（如 LPS 诱导 NO 释放）→ ③ 荧光检测，全程 1-2 小时（Griess 法需 4-6 小时，含样本提取步骤），大幅提升实验效率。

无需细胞裂解或样本转移：直接对活细胞进行染色与检测，避免 NO 在样本处理过程中的挥发或氧化（NO 半衰期仅 3-5 秒），真实反映细胞内 NO 的实时水平。

适配多检测平台，应用场景灵活

兼容荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板 reader 等常规设备，无需特殊仪器：

共聚焦 / 显微镜：观察 NO 在细胞内的空间分布（如内皮细胞中 NO 主要产生于细胞膜附近）；

流式细胞术：定量细胞群中 NO 阳性细胞比例（如炎症状态下巨噬细胞 NO 阳性率从 10% 升至 60%）；

微孔板 reader：高通量筛选影响 NO 释放的药物（如抗炎药对 LPS 诱导 NO 的抑制作用）。

三、活细胞兼容性与功能拓展

低毒性，不干扰 NO 生成与细胞功能

染料工作浓度（1-5 μM）下，对细胞活性、NO 合成酶（NOS，如 iNOS、eNOS）活性无影响：

内皮细胞：标记后 eNOS 介导的 NO 释放正常，血管舒张功能不受损；

巨噬细胞：不抑制 LPS 诱导的 iNOS 表达，可准确检测炎症状态下的 NO 动态变化。

无 NO scavenger（清除剂）效应：染料仅与 NO 发生反应，不消耗细胞内 NO 储备，避免检测过程中人为改变 NO 稳态。

支持多维度联用，拓展研究深度

与其他荧光探针联用：可同步检测 NO 与 ROS（如 DAF-FM DA+6-CDCFDA）、线粒体膜电位（DAF-FM DA+MitoBright CMXRos），分析 NO 与细胞氧化应激、线粒体功能的关联（如 NO 过量导致线粒体膜电位下降）。

适配多种样本类型：可检测贴壁细胞、悬浮细胞、3D 细胞球（如肿瘤类器官）及薄组织切片（如小鼠主动脉切片），3D 样本仅需延长染料孵育时间（40 分钟），确保探针渗透至内部细胞。

四、典型应用场景

炎症反应与免疫功能研究

巨噬细胞 NO 释放检测：用 LPS 刺激巨噬细胞，试剂盒染色后通过流式细胞术检测 —— 刺激 6 小时后 NO 荧光强度升高 3 倍，阳性细胞比例从 8% 升至 75%，量化炎症状态下 iNOS 的激活程度，评估抗炎药物（如地塞米松）的抑制效果。

肠道炎症模型：标记小鼠肠道类器官，检测炎症因子（如 TNF-α）刺激下的 NO 变化 —— 类器官边缘细胞 NO 荧光显著增强，反映肠道上皮的炎症应答，关联炎症性肠病（IBD）的病理机制。

血管功能与心血管研究

内皮细胞 NO 合成：标记血管内皮细胞，检测乙酰胆碱（ACh）刺激下的 NO 释放 ——ACh 激活 eNOS，5 分钟内 NO 荧光强度升高 2 倍，通过共聚焦成像观察 NO 在血管内皮的分布，分析血管舒张功能与 NO 的关联。

心血管药物筛选：96 孔板培养内皮细胞，加入候选药物（如硝酸酯类药物），微孔板 reader 检测 NO 荧光变化，筛选能促进 NO 释放的药物，评估其对血管保护的潜在作用。

神经科学与信号传导

神经元 NO 信号：标记海马神经元，检测 NMDA 受体激活后的 NO 变化 ——NMDA 刺激后，神经元胞体与树突的 NO 荧光升高 1.5 倍，反映 NO 在突触可塑性（如长时程增强 LTP）中的信号作用，研究阿尔茨海默病中 NO 信号的异常。

五、技术优化与注意事项

试剂与孵育控制

染料储存：试剂盒需避光 - 20℃保存，避免反复冻融（建议分装为单次用量）；稀释后的染料需现配现用，防止降解。

孵育条件：37℃、5% CO?孵育 20-30 分钟，贴壁细胞可轻轻摇晃培养皿确保染料均匀接触；避免高浓度染料（＞10 μM）导致的非特异性荧光或细胞毒性。

干扰因素排除

避免 NO 污染：实验需使用无 NO 的缓冲液（如新鲜配制的 PBS，避免反复开盖），培养环境需通风，防止空气中 NO?的干扰。

光漂白防护：成像时使用抗淬灭培养基（如 ProLong Live），激光强度控制在 10-20%（488 nm 激光），减少强光对荧光信号的衰减。

定量校准

需使用 NO 标准品（如 SNP，亚硝基铁氰化物）绘制标准曲线：用不同浓度 SNP（10 nM-1 μM）处理已染色细胞，检测荧光强度，建立 “荧光强度 - NO 浓度” 线性关系，确保定量准确性。

总结

NO 检测试剂盒（荧光染料法）凭借 “NO 特异性高 + 操作简便 + 活细胞兼容 + 高通量适配” 的核心优势，成为 NO 研究的主流工具，尤其适合炎症反应、血管功能及药物筛选场景。相比传统方法，其避免了样本处理的干扰与操作复杂性，同时能实时捕捉 NO 动态变化，为细胞信号传导、疾病机制研究提供了精准的检测方案。

本文引用地址：https://www.med-life.cn/product/1296522.html

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