BCECF AM pH 荧光指示剂（5mM，绿色） 是一种可以穿透细胞膜检测细胞内 pH 的荧光染料。BCECF AM pH 荧光指示剂（5mM，绿色） 没有荧光，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成 BCECF，从而被滞留在细胞内，BCECF 在适当的 pH 值条件下可以被激发形成绿色荧光，最大激发波长和发射波长因 pH 的不同而有所不同，最大激发波长在 503 nm 左右，最大发射波长在 520 nm 左右，实际检测时推荐使用的激发波长为 488 nm，发射波长为 535 nm。

BCECF AM pH 荧光指示剂（5mM，绿色） 不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的体内 pH 水平检测。此外，在细胞内有 pH 变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中 BCECF AM pH 荧光指示剂（5mM，绿色） 也被广泛应用。

一、核心优势：pH 特异性比率荧光与高精准度

双发射比率荧光，消除干扰更精准

BCECF AM 为非荧光脂溶性前体（分子量≈649 Da），含乙酰甲酯（AM）基团，可自由穿透活细胞膜；进入细胞后，被胞内酯酶水解为水溶性的 BCECF（带负电荷，无法跨膜扩散）。

BCECF 具有pH 依赖性双发射特性：在固定激发波长（如 440 nm 和 490 nm）下，发射波长均为 535 nm，且 490 nm 激发的荧光强度随 pH 升高而增强，440 nm 激发的荧光强度基本不变（作为参比）。通过计算 “490 nm/440 nm 荧光比值”，可直接定量细胞内 pH 值，完全消除细胞密度、探针浓度、光漂白等因素的干扰，检测精度达 ±0.05 pH 单位（远超单波长荧光探针的 ±0.2 pH 单位）。

适配生理 pH 范围，覆盖细胞酸碱状态

荧光比值与 pH 值在 6.0-8.0 范围内呈良好线性关系（解离常数 pKa≈6.98），完美覆盖活细胞内生理 pH 区间（胞质 pH≈7.2-7.4，溶酶体 pH≈4.5-5.5，可通过细胞器靶向修饰拓展检测范围）。

既能检测细胞酸中毒（如缺氧导致的 pH 下降至 6.5），也能监测碱中毒（如碳酸氢盐摄入过多导致的 pH 升高至 7.8），适合细胞酸碱平衡紊乱相关的病理机制研究。

二、5mM 浓度的实用优势：稳定与灵活兼顾

高浓度储备液，长期保存损耗低

5mM 浓度通常以无水 DMSO 为溶剂，避光 - 20℃密封保存时，稳定期长达 12 个月以上（低浓度＜1mM 储备液易因 DMSO 挥发或水解降解，稳定期仅 2-3 个月），减少反复配制的试剂浪费，降低批次间误差。

单次使用时可按需灵活稀释：按 1:1000-1:2500 比例稀释，即可获得 2-5μM 的工作浓度，适配不同实验体系（如 96 孔板单孔 100μL、共聚焦成像 35mm 皿 500μL、流式细胞术 1mL 样本管），无需调整储备液浓度，操作效率高。

适配多检测平台，无需参数调整

稀释后的工作液可直接用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板 reader 等常规设备，均适配 “440 nm/490 nm 双激发、535 nm 发射” 的参数设置，无需因检测平台不同重新优化，尤其适合高通量实验（如 96 孔板药物对细胞 pH 影响的筛选），可批量稀释后统一加样，保证实验重复性。

三、活细胞兼容性：低毒性与高滞留率

极低毒性，不干扰细胞功能

工作浓度（2-5μM）下，对细胞活性、增殖及酸碱平衡调节机制无显著影响：

上皮细胞：标记后 Na?/H?交换体活性正常，可正常调节胞质 pH，无细胞凋亡或代谢紊乱；

免疫细胞：不影响巨噬细胞的吞噬功能或 T 细胞的活化过程，可准确检测免疫应答中的细胞内 pH 变化。

无 pH 缓冲副作用：BCECF 与细胞内酸碱物质无相互作用，不会干扰细胞自身的 pH 稳态，检测结果更贴近真实生理状态。

高细胞内滞留率，适合长时间监测

水解后的 BCECF 因带负电荷，在细胞内的滞留率超 95%（单波长 pH 探针如 SNARF-1 的滞留率约 80%），荧光信号可在活细胞内维持 24 小时以上，抗光漂白能力优异（共聚焦连续扫描 30 分钟，荧光比值变化＜5%），适合长时间动态监测（如细胞缺氧 12 小时内的 pH 渐变过程）。

四、典型应用场景

细胞酸碱平衡动态监测

缺氧病理研究：BCECF AM 标记心肌细胞，通过共聚焦显微镜监测缺氧处理下的胞质 pH 变化 —— 缺氧 2 小时后 pH 从 7.3 降至 6.8，4 小时后降至 6.5，同时观察到 Na?/H?交换体激活（pH 下降速率减缓），揭示缺氧导致细胞酸中毒的机制；

上皮细胞运输功能：标记肾小管上皮细胞，检测其对碳酸氢盐的重吸收过程 —— 加入碳酸氢盐后，胞质 pH 从 7.2 升高至 7.5，量化 Na?/HCO??共转运体的活性，研究肾脏酸碱调节功能。

药物筛选与毒性评估

质子泵抑制剂筛选：96 孔板培养胃壁细胞，加入 BCECF AM 与候选质子泵抑制剂（如奥美拉唑类似物），微孔板 reader 检测药物对细胞内 pH 的影响 —— 有效药物可使胞质 pH 从 7.0 升高至 7.3（抑制 H?外排），通过荧光比值计算 IC??，实现高通量初筛；

化疗药物毒性检测：检测顺铂对肿瘤细胞 pH 的影响 —— 顺铂处理后，胞质 pH 从 7.3 降至 6.9（抑制酸碱调节泵），荧光比值下降 20%，可通过 pH 变化评估药物对细胞代谢的损伤程度。

细胞器 pH 分析（需靶向修饰）

溶酶体 pH 检测：将 BCECF AM 与溶酶体靶向肽（如 Tat 肽）偶联，标记后通过 “490 nm/440 nm 比值” 检测溶酶体 pH（正常约 4.8，酸性药物处理后升至 5.5），研究药物对溶酶体功能的影响；

线粒体 pH 检测：与线粒体靶向基团（如三苯基膦）偶联，检测线粒体基质 pH（正常约 8.0，氧化应激后降至 7.5），关联线粒体功能损伤与 pH 变化。

五、技术优化与注意事项

稀释与孵育控制

储备液稀释：5mM BCECF AM 用无血清培养基（如 DMEM、RPMI 1640）稀释至 2-5μM，避免使用含血清培养基（血清中的酯酶可能提前水解 AM 基团，导致背景升高）；稀释后需现配现用，防止 DMSO 挥发影响浓度。

孵育条件：37℃、5% CO?孵育 30-40 分钟，贴壁细胞可轻轻摇晃培养皿确保探针均匀接触；悬浮细胞需低速离心（500×g，5 分钟）去除未进入细胞的探针，降低背景。

pH 定量与校准

必须进行标准曲线校准：使用 pH 梯度标准液（如 pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）处理已染色细胞，检测各 pH 下的 “490 nm/440 nm 荧光比值”，绘制标准曲线，后续通过样本比值在曲线上查找对应 pH 值，确保定量准确性。

避免温度干扰：BCECF 荧光比值受温度影响较小（＜0.01 pH 单位 /℃），但实验需保持温度恒定（如 37℃），避免温度波动导致的误差。

干扰因素排除

若样本含高浓度还原剂（如谷胱甘肽），可加入 1mM 维生素 C（不影响 pH 检测）中和，防止 BCECF 被还原导致荧光淬灭；

若细胞自发荧光较强（如含色素的细胞），可设置 “未加探针的细胞” 作为空白对照，通过软件扣除背景荧光后再计算比值。

总结

BCECF AM（5mM，绿色）凭借 “pH 比率荧光精准定量 + 5mM 储备液稳定灵活 + 低毒性高滞留率” 的核心优势，成为细胞内 pH 检测的金标准工具，尤其适合酸碱平衡动态监测、高通量药物筛选及细胞器 pH 分析。相比单波长 pH 探针，其检测精度与抗干扰能力显著提升；相比其他比率探针，其储备稳定性与适用范围更优，5mM 浓度更是为长期实验与批量操作提供了极大便利，是细胞生理学、药理学研究的高效探针。

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