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2025-10-29

标题：ISO 10993-5:2009医疗器械生物学评价标准方法

项目名称：体外细胞毒性试验，参照ISO10993-5:2009：MTT含10%胎牛血清的MEM浸提

参考标准

ISO 10993-5:2009 医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验

执行规范

ISO/EC 17025:2017 检测和校准实验室能力的通用要求(CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则》)中国合格评定国家认可委员会实验室认可注册号: CNAS L2954。

RB/T 214-2017《检验检测机构资质认定能力评价检验检测机构通用要求》中国国家认证认可监督管理委员会检验检测机构资质认定证书编号:CMA180015144061。：

试验用到的试剂和仪器

阴性对照样品：高密度聚乙烯制造商:美国药典委员会（USP）
阳性对照样品：Zinc diethyldithiocarbamate 制造商：sigma
浸提介质：含10%胎牛血清的MEM 培养液
细胞系：小鼠成纤维细胞 L929,细胞系来自美国菌种保存中心
涉及的试剂：

试剂名称	供应商
MTT(噻唑蓝）	SIGMA（进口）、Perfemiker（国产）
胎牛血清	CORNING、Gibco
MEM	HyClone
胰酶	Gibco
青霉素链霉素	Gibco
PBS	HyClone、Perfemiker
99.9%异丙醇	国药、阿拉丁、Perfemiker
芝麻油（注射级）	Perfemiker（博飞美科）

涉及的仪器设备：

高压灭菌器、恒温摇床、钢直尺、电子天平、CO?培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酶联免疫检测仪

试验步骤

试验过程无菌操作；

将L929细胞培养在含10%胎牛血清和抗生素（青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL)的MEM培养液中，置于37C，5%CO2培养箱中培养。用0.25%胰酶（含EDTA）消化细胞制备成单细胞悬液，细胞悬液离心（200G，3min），然后将细胞重新分散于培养基中，调整细胞密度为1×102个/mL的细胞悬液；

接种上述细胞悬液到1个96孔培养板中，每孔100μL，置37C培养箱（5%CO2，37℃，>90%湿度）培养24h；待细胞长成单层后，吸出原来的培养液，分别加入100μL不同浓度的试验样品浸提液（100%、50%、25%、12.5%）、空白对照液、阳性对照（100%）和阴性对照液（100%），37 ℃，5%CO2培养24h。每组做5个平行样；

培养24h后，取出96孔板先做细胞形态学观察，然后吸出原来的培养液，每孔加50μL MTT（1mg/mL），置于37°C，5%CO2培养箱中培养2h，吸弃上清，加100μL 99.9%纯度的异丙醇溶解结晶；

在酶标仪上以570nm为主吸收波长，650nm为参考波长测定吸光度值。

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评价项目	常用试剂/工具
体外细胞毒性（ISO?109935）	琼脂、MTT、XTT、CCK8、活细胞/死细胞双染（CalceinAM/PI）、Hatano FDSC阳性对照塑料片RM-A/B/F、阴性对照RM-C/H、RM-D/E
细胞增殖/克隆形成	克隆形成试剂盒（ColonyForming Unit）
刺激性（ISO?1099310）	皮内注射液（生理盐水、PBS）+ 组织学染色（HE、Masson染色）、SDS
致敏性（GPMT、LLNA）	弗氏完全佐剂（FCA）/不完全弗氏佐剂（IFA）、2,4-二硝基氯苯（DNCB）、SDS
植入后局部反应试验	MTT/LDH染色剂、HE、Masson染色
血液相容性	Glass beads,Positive Control 2mm（凝血）、TBE麻醉剂、溶血试剂盒（血红蛋白释放测定）、血红蛋白检测试剂盒、血小板黏附/聚集试剂盒
内毒素检测	LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试剂盒（GelClot、Chromogenic）
热原（发热）	RPT（Rabbit Pyrogen Test）血清检测套装、MAT / HWB（IL?1β、IL?6 ELISA）
全身毒性试验	血清学检测试剂盒（ALT、AST、BUN、CREA 等）
遗传毒性	Ames试验：TA98、TA100、TA1535、TA1537、E.?coli WP2 uvrA、Mouse Lymphoma Assay（L5178Y）、亚硝基苯 (NaN?)、2?氨基萘 (2?AA)
染色体畸变	环磷酰胺、酶诱导剂（如Aroclor?1254、苯巴比妥?+?β?萘黄酮）、Colcemid、Giemsa染色
体外血管化/血流模拟	微流体芯片（PDMS、玻璃）+ 集成电极
3D/多孔材料细胞黏附	骨细胞/成骨细胞培养基（αMEM + 10?% FBS）+ 骨形态蛋白（BMP2）
组织学/免疫组化	抗体（CD68、αSMA、COLI）+ DAB 显色试剂
浸提物/溶出物（Extractables & Leachables）?	乙醇、油相（如芝麻油）

*以上内容参考国家相关标准汇总整理。

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