Fluo-4 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 是一种将 Fluo-3 结构中的氯离子替换成氟离子的钙荧光探针。由于将氯离子替换成了电子吸引力更强的氟离子，它的最大激发波长会向短波长方向偏离 10 nm 左右，这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo-4 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 的荧光强度比 Fluo-3 更强。

Fluo-4 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-4 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色），从而被滞留在细胞内。Fluo-4 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

?一、核心优势：Ca2?检测性能的全面升级

超快响应速度，捕捉瞬时钙信号

Fluo-4 AM 进入细胞水解为 Fluo-4 后，与 Ca2?的结合动力学常数更高，响应时间＜50ms（Fluo-3 AM 约 100ms），可精准捕捉极短的钙信号事件 —— 如神经细胞动作电位伴随的 “钙尖峰”（持续仅几十毫秒）、心肌细胞收缩周期中的快速钙瞬变，避免因响应滞后导致的信号遗漏。

解离常数 Kd≈345 nM，与生理状态下细胞内游离 Ca2?浓度（100nM-1μM）高度匹配，既能灵敏检测静息态到激活态的钙升高，也能准确反映钙信号的衰减过程，量化精度优于同类探针。

超强荧光信号，低背景高信噪比

结合 Ca2?后荧光量子产率达 0.65，荧光增强倍数超 100 倍（Fluo-3 AM 约 60 倍），即使在低 Ca2?浓度（如静息态 100nM）下，也能产生可检测的基础荧光；激活态荧光亮度比 Fluo-3 AM 高 30% 以上，在高分辨率成像（如共聚焦、超分辨显微镜）中，可清晰观察钙信号在细胞内的空间分布（如突触前膜、线粒体附近的局部钙升高）。

绿色荧光（激发 / 发射≈494/516 nm）远离细胞自发荧光波段，在复杂样本（如组织切片、3D 类器官）中背景噪音低，信噪比可达 40:1 以上，避免非特异性信号干扰。

二、2mM 浓度的实用优势：稳定与灵活兼顾

高浓度储备液，长期保存损耗低

2mM 浓度通常以无水 DMSO 为溶剂，避光 - 20℃密封保存时，稳定期长达 6-12 个月（低浓度＜100μM 储备液易因 DMSO 挥发或水解降解，稳定期仅 1-2 个月），减少反复配制的试剂浪费，降低实验误差。

单次使用时可按需灵活稀释：按 1:400-1:1000 比例稀释，即可获得 2-5μM 的工作浓度，适配不同实验体系（如 96 孔板单孔 100μL、共聚焦成像 35mm 皿 500μL、流式细胞术 1mL 样本管），无需调整储备液浓度，操作效率高。

适配全平台检测，无需参数调整

稀释后的工作液可直接用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板 reader 等常规设备，均适配 488nm 激发光与 515-530nm 发射滤光片，无需因检测平台不同重新优化参数。

尤其适合高通量实验：批量稀释 2mM 储备液后，可一次性完成 96 孔板或 384 孔板的加样，保证每孔探针浓度一致，实验重复性优于低浓度储备液分次配制。

三、活细胞兼容性：低毒性与功能友好

极低毒性，不干扰钙稳态与细胞功能

工作浓度（2-5μM）下，对细胞活性、增殖及钙信号通路无显著影响：

神经细胞：标记后轴突生长速度、突触传递效率与未标记组一致，可连续 24 小时观察钙信号动态，无神经元凋亡；

心肌细胞：不影响心肌收缩频率（如大鼠心肌细胞约 60 次 / 分钟）与钙瞬变周期，适合心脏生理与病理状态下的钙信号研究；

免疫细胞：不抑制 T 细胞活化或巨噬细胞吞噬功能，可准确检测免疫激活过程中的钙信号变化。

无钙螯合副作用：与 Ca2?结合后不消耗细胞内钙库（如内质网、线粒体钙储备），避免探针自身导致的钙稳态失衡，检测结果更贴近细胞真实生理状态。

穿透性强，适配多样本类型

对贴壁细胞（如 HeLa、神经元）、悬浮细胞（如 Jurkat T 细胞、血细胞）、3D 细胞球（如肿瘤类器官、胰岛类器官）均有良好的穿透性：

3D 样本无需复杂处理，仅需延长孵育时间至 30-40 分钟（或加入 0.02% Pluronic F-127 助渗透），即可使探针均匀分布至类器官内部细胞，检测深层细胞的钙信号。

四、典型应用场景

高速钙信号动态监测

神经科学：共聚焦显微镜高速成像（帧频＞50fps），观察海马神经元接受电刺激后，突触前膜局部钙信号的瞬时升高（＜100ms 内荧光强度提升 4-6 倍），分析神经递质释放与钙信号的时空关联；

心肌细胞研究：标记大鼠原代心肌细胞，通过离子成像系统捕捉收缩周期中的钙瞬变（上升时间＜100ms，下降时间≈300ms），量化药物（如 β 受体激动剂）对钙瞬变幅度与速度的影响。

高通量药物筛选与毒性评估

钙通道药物筛选：384 孔板培养 CHO 细胞（稳定表达钙通道），加入 Fluo-4 AM 与候选药物，微孔板 reader 检测 KCl 刺激后的荧光强度，筛选能激活或抑制钙通道的药物，1 天内可完成上千个化合物的初筛；

毒性物质检测：检测环境毒素（如百草枯、重金属）对细胞钙稳态的破坏 —— 毒素处理后，Fluo-4 荧光持续升高（钙库泄漏），通过荧光强度量化毒性等级，比传统细胞活力检测更灵敏。

细胞功能与病理机制研究

细胞凋亡早期检测：凋亡诱导剂（如星形孢菌素）处理 HeLa 细胞，Fluo-4 荧光先快速升高（内质网钙释放，10 分钟内达峰值）后缓慢下降，比 Annexin V（2-3 小时阳性）早 1-2 小时捕捉凋亡信号，揭示钙失衡是凋亡早期关键事件；

胰岛 β 细胞功能检测：标记胰岛 β 细胞，观察葡萄糖刺激下的钙信号升高（荧光强度提升 2-3 倍），量化钙信号幅度与胰岛素分泌量的关联，评估糖尿病模型中 β 细胞功能的损伤程度。

五、技术优化与注意事项

稀释与孵育控制

储备液稀释：2mM Fluo-4 AM 用无血清培养基（如 DMEM、RPMI 1640）稀释至 2-5μM，避免使用含血清培养基（血清中的酯酶可能提前水解 AM 基团，导致背景升高）；稀释后需现配现用，防止 DMSO 挥发影响浓度。

孵育条件：37℃、5% CO?孵育 20-30 分钟，贴壁细胞可轻轻摇晃培养皿确保探针均匀接触；3D 类器官需延长至 40 分钟，并加入 0.02% Pluronic F-127（降低探针聚集，提升渗透效率）。

信号特异性与定量

需设置对照验证：阳性对照（离子霉素处理，使 Ca2?完全释放，获取荧光最大值 Fmax）、阴性对照（EGTA 处理，螯合游离 Ca2?，获取荧光最小值 Fmin），通过公式 [Ca2?] = Kd × (F - Fmin)/(Fmax - F) 计算游离 Ca2?浓度（Kd 取 345 nM）。

避免光漂白：成像时使用抗淬灭培养基（如 ProLong Live Antifade），激光强度控制在 10-15%（488nm 激光），减少强光对荧光信号的衰减。

干扰因素排除

若样本含高浓度金属离子（如 Fe3?、Cu2?），可加入 1mM EDTA（不影响 Ca2?检测）螯合干扰离子；

若细胞自发荧光较强（如含色素的黑色素瘤细胞），可设置 “未加探针的细胞” 作为空白对照，通过软件扣除背景荧光。

总结

Fluo-4 AM（2mM，绿色）凭借 “超快响应速度 + 超强荧光信号 + 2mM 储备液稳定灵活 + 低毒性” 的核心优势，成为细胞钙信号研究的升级款工具，尤其适合高速钙瞬变监测、高分辨率成像及高通量药物筛选。相比 Fluo-3 AM，其性能全面提升；相比 Fura-2 AM，其检测平台更灵活、操作更简便，2mM 浓度更是为长期实验与批量操作提供了极大便利，是钙信号研究领域的 “高性能优选探针”。

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