Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 是一种广泛使用的长波长荧光钙指示剂。该指示剂的吸收波长为 506 nm，因此能被 488 氩离子激光有效激发。在没有 Ca2+ 存在的情况下，Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 基本上没有荧光，但当与 Ca2+ 结合时， 526 nm 波长处的荧光至少会增加 40 倍。与 Fura-2 和 Indo-1 不同，Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 的激发和发射最大值在与 Ca2+ 结合前后都没有明显变化。因此，Ca2+] 的比率测量技术不适用于 Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色），此外，由于 Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 与 Ca2+ 的结合力比 Fura-2 和 Indo-1 弱，它更适用于测量 Ca2+ 尖峰时的高瞬 Ca2+ 浓度。

Fluo-3, AM 酯是 Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 的一种膜渗透形式，可通过孵育载入细胞。然而，一旦进入细胞，它就会被细胞质酯酶水解为 Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（2mM，绿色） 游离酸。

一、核心优势：Ca2?特异性响应与高灵敏度

Ca2?介导的荧光激活，特异性无交叉

Fluo-3 AM 为非荧光脂溶性前体（分子量≈1091 Da），含乙酰甲酯（AM）基团，可自由穿透活细胞膜；进入细胞后，被胞内酯酶水解为水溶性的 Fluo-3（带负电荷，无法跨膜扩散）。

游离状态的 Fluo-3 无荧光，仅与细胞内游离 Ca2?结合后（解离常数 Kd≈390 nM，适配生理 Ca2?浓度：100nM-1μM），才发出强绿色荧光（激发 / 发射≈488/525 nm），荧光强度与游离 Ca2?浓度呈正相关，对 Mg2?、Na?等其他阳离子无响应，特异性达 99% 以上，避免离子干扰导致的假阳性。

高灵敏度，捕捉细微 Ca2?波动

结合 Ca2?后荧光量子产率从 0.01 升至 0.6，荧光增强倍数超 60 倍（远超同类探针 Fura-2 的 30 倍），可检测到低至 10nM 的 Ca2?浓度变化（如细胞静息态→激活态的 Ca2?瞬时升高）。

2mM 储备液稀释后（工作浓度 2-5μM）即可满足检测需求，低浓度下仍能捕捉快速钙信号（如神经细胞动作电位伴随的 Ca2?尖峰，响应时间＜100ms），适合动态钙信号追踪。

二、2mM 浓度的实用优势：储备稳定与灵活适配

高浓度储备液，长期稳定易保存

2mM 浓度通常以无水 DMSO 为溶剂，避光 - 20℃保存时可稳定 6 个月以上（低浓度储备液＜100μM 易降解，稳定期仅 1 个月），减少反复配制的麻烦，降低试剂损耗。

单次使用时按需稀释（如稀释 400-1000 倍至 2-5μM 工作浓度），适配不同样本量（如 96 孔板单孔 100μL 体系、共聚焦成像的 35mm 皿 500μL 体系），灵活性高，无需调整储备液浓度。

适配多检测平台，无需额外优化

稀释后可直接用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板 reader 等常规平台，无需因浓度调整激发 / 发射参数（均适配 488nm 激发、525nm 发射），尤其适合高通量实验（如 96 孔板钙信号药物筛选），可批量稀释后统一加样，保证实验重复性。

三、活细胞兼容性与操作优势

低毒性，不干扰细胞功能

工作浓度（2-5μM）下，对细胞活性、增殖及钙信号通路无显著影响：

神经细胞：标记后动作电位发放频率正常，突触传递功能不受损，可长期观察（＞24 小时）钙信号动态；

心肌细胞：不影响心肌收缩频率与钙瞬变周期，适合心脏生理相关的钙信号研究。

无钙螯合毒性：与 Ca2?结合后不影响细胞内总钙库（如内质网、线粒体钙储备），避免探针自身对钙稳态的干扰，确保检测结果反映真实细胞状态。

操作简便，无需复杂预处理

染色流程简单：细胞贴壁后加入稀释好的 Fluo-3 AM 工作液，37℃孵育 20-30 分钟即可，无需透膜（AM 基团助其跨膜）、洗涤（少量胞外未水解前体不影响信号，若需低背景可洗涤 1 次），比免疫荧光标记节省 3-4 小时。

适配多种细胞类型：贴壁细胞（如神经元、心肌细胞）、悬浮细胞（如免疫细胞、血细胞）、3D 细胞球（如肿瘤类器官）均适用，仅需根据样本调整孵育时间（3D 细胞球需延长至 40 分钟，确保探针渗透至内部细胞）。

四、典型应用场景

细胞钙信号动态监测

神经科学：Fluo-3 AM 标记原代神经元，共聚焦延时成像观察谷氨酸刺激下的胞内 Ca2?升高（荧光强度 10 秒内提升 3-5 倍），分析突触前递质释放与钙信号的关联；

免疫细胞激活：标记 T 细胞，通过流式细胞术检测 TCR 激活后 Ca2?浓度变化（荧光峰出现时间＜30 秒），量化 T 细胞活化比例，评估免疫应答强度。

药物筛选与毒性评估

钙通道药物筛选：96 孔板培养心肌细胞，加入 Fluo-3 AM 与候选钙通道抑制剂（如硝苯地平），微孔板 reader 检测 KCl 刺激后的荧光强度，筛选能抑制 Ca2?内流的药物，计算 IC??；

毒性评估：检测重金属（如 Pb2?、Hg2?）对细胞钙稳态的破坏 —— 毒性物质处理后，Fluo-3 荧光持续升高（钙库泄漏），可通过荧光强度量化毒性等级。

细胞功能与病理研究

凋亡早期检测：凋亡诱导剂（如星形孢菌素）处理细胞，Fluo-3 荧光先短暂升高（钙库释放）后下降，比 Annexin V 早 1-2 小时捕捉凋亡信号，反映钙稳态失衡是凋亡早期事件；

肌肉收缩研究：标记骨骼肌细胞，观察电刺激下的钙瞬变（荧光强度随收缩周期波动），分析肌肉疲劳时钙信号的衰减规律，研究肌营养不良等疾病的病理机制。

五、技术优化与注意事项

稀释与孵育控制

储备液稀释：2mM Fluo-3 AM 用无血清培养基稀释至 2-5μM，避免用含血清培养基（血清酯酶可能提前水解 AM 基团）；稀释后需现配现用，避免 DMSO 挥发导致浓度偏差。

孵育条件：37℃、5% CO?孵育 20-30 分钟，贴壁细胞可轻轻摇晃培养皿，确保探针均匀接触细胞；3D 细胞球需延长至 40 分钟，必要时加入 0.02% Pluronic F-127（助探针渗透）。

避免荧光漂白与干扰

成像时使用抗淬灭培养基（如 ProLong Live），激光强度控制在 10-20%（488nm 激光），避免强光长时间照射导致荧光衰减；

若样本含自发荧光（如色素细胞），可设置空白对照（未加探针的细胞），通过软件扣除背景荧光，提升数据准确性。

钙浓度定量方法

需设置阳性对照（如离子霉素处理，使 Ca2?完全释放，荧光达最大值 Fmax）与阴性对照（如 EGTA 处理，螯合所有 Ca2?，荧光达最小值 Fmin），通过公式 [Ca2?] = Kd × (F - Fmin)/(Fmax - F) 计算游离 Ca2?浓度。

总结

Fluo-3 AM（2mM，绿色）凭借 “Ca2?特异性高 + 灵敏度强 + 2mM 储备液稳定灵活 + 低毒性” 的核心优势，成为细胞钙信号研究的经典工具，尤其适合动态钙信号追踪、高通量药物筛选及基础细胞功能研究。相比 Fura-2 AM，其检测平台更灵活；相比 Fluo-4 AM，其成本更低、适用性更广，2mM 浓度更是为长期实验与批量操作提供了便利，是实验室钙信号研究的 “入门级优选探针”。

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