4-Di-1-ASP 线粒体荧光探针（红色） 是苯乙烯基染料，用于染色活细胞线粒体。常被用于染色神经胶质瘤细胞、活体大脑组织等。

一、核心优势：线粒体靶向精准性与膜电位敏感性

双重作用机制实现高特异性定位

4-Di-1-ASP 分子含亲脂性苯乙烯基长链与阳离子吡啶基团：长链通过疏水作用嵌入线粒体膜脂质双分子层，阳离子基团则借助线粒体膜电位（ΔΨm，-150~-180 mV）的静电引力富集于线粒体基质，定位特异性达 98% 以上，几乎不与内质网、溶酶体等其他细胞器交叉染色（脱靶率＜2%）。

与传统线粒体探针（如罗丹明 123）相比，其对线粒体的亲和力更强，即使在细胞快速迁移或线粒体剧烈融合 / 分裂时，仍能稳定锚定，避免信号漂移，适合捕捉线粒体动态变化（如神经元轴突中线粒体的双向运输）。

膜电位敏感性高，功能状态可视化

荧光强度与线粒体膜电位直接正相关：健康细胞膜电位高，探针富集多，红色荧光强（激发 / 发射≈551/576 nm）；膜电位下降（如早期凋亡、氧化应激）时，探针外溢，荧光减弱；膜电位完全丧失（坏死细胞）时，荧光消失，可通过荧光变化直观区分细胞线粒体功能状态，无需复杂比值计算（如 JC-1 的红绿信号比），检测更便捷。

二、红色荧光的光谱优势与实验兼容性

低背景干扰，深层成像能力强

红色荧光（576 nm 发射）远离细胞自发荧光的主要波段（蓝色 / 绿色，发射峰＜550 nm），在复杂样本（如神经组织切片、肿瘤类器官）中背景噪音比绿色探针（如罗丹明 123）降低约 50%，信噪比可达 35:1 以上，线粒体细微结构（如神经元树突中的线粒体、心肌细胞的肌浆网线粒体）清晰可辨。

红色光在生物组织中的散射少，穿透深度可达 40-60 μm（绿色探针约 20-30 μm），可观察 3D 细胞球内部或薄组织切片深层细胞的线粒体分布，无需过度切片即可获取完整线粒体形态信息。

多色实验灵活联用，无串扰

与绿色、蓝色探针光谱分离度高，串扰率＜1.5%，可构建 “线粒体 + 其他靶点” 的多维度检测体系：

4-Di-1-ASP（线粒体，红色）+ FITC - 鬼笔环肽（细胞骨架，绿色）+ DAPI（细胞核，蓝色）：同步观察线粒体分布、细胞骨架形态与核定位，分析线粒体与骨架的关联（如迁移细胞中线粒体沿骨架定向分布）；

流式实验中，可与 PE-CD3（免疫表型）、7-AAD（细胞活性）联用，量化不同免疫细胞亚群的线粒体膜电位差异（如活化 T 细胞膜电位高于静息 T 细胞），细胞群分群更精准。

三、活细胞兼容性与操作优势

低毒性，适配敏感样本与长期观察

工作浓度（1-5 μM）下，对线粒体呼吸链活性（ATP 生成量）、细胞增殖及功能无显著影响（神经元细胞存活率＞95%，神经递质释放量与未标记组一致），尤其适合神经细胞、胚胎干细胞等敏感样本 —— 例如标记原代神经元后，可连续 48 小时观察轴突中线粒体的运输动态，无神经元凋亡或轴突断裂。

不诱导氧化应激：探针自身 ROS 生成量＜3%，避免因标记导致的线粒体损伤，适合研究细胞生理状态下的线粒体功能（如缺氧、营养缺乏对线粒体膜电位的影响）。

操作简便，适配多检测平台

染色步骤简单：直接加入培养基或缓冲液（如 HBSS），37℃孵育 10-20 分钟即可，无需透膜、固定或洗涤（少量胞质游离探针不影响信号），比免疫荧光标记节省 2-3 小时，适合高通量实验（如 96 孔板药物筛选）；

兼容多种检测手段：

荧光显微镜 / 共聚焦：观察线粒体形态与动态（如融合、分裂、沿微管运输）；

流式细胞术：定量细胞群线粒体膜电位异质性（如肿瘤细胞中低荧光亚群比例反映凋亡程度）；

活体成像：标记斑马鱼胚胎线粒体，观察早期胚胎发育中线粒体的分布与功能变化。

四、典型应用场景

神经细胞线粒体研究

神经元线粒体运输：4-Di-1-ASP 标记原代海马神经元，通过延时摄影观察轴突中线粒体的双向运输（向轴突末梢或胞体移动），量化运输速度（正常情况下约 0.5-1 μm/s），分析阿尔茨海默病模型中运输速率下降与 tau 蛋白异常的关联。

细胞凋亡与药物筛选

凋亡早期检测：用化疗药（如顺铂）处理肿瘤细胞，1 小时后即可观察到 4-Di-1-ASP 荧光减弱（膜电位下降），比 Annexin V（2-3 小时阳性）更早捕捉凋亡信号，流式细胞术可定量低荧光细胞比例，评估药物诱导凋亡效率；

线粒体保护药物筛选：96 孔板培养心肌细胞，加入候选药物与氧化应激诱导剂（如 H?O?），通过荧光强度筛选能维持红色荧光的药物（如辅酶 Q10 衍生物），直观反映药物对线粒体膜电位的保护作用。

发育生物学研究

斑马鱼胚胎发育：4-Di-1-ASP 标记斑马鱼早期胚胎，荧光显微镜观察不同发育阶段（如囊胚期、原肠期）线粒体的分布变化 —— 囊胚期线粒体均匀分布，原肠期逐渐向细胞分化区域富集，反映线粒体功能与细胞分化的关联。

五、技术优化与注意事项

染色浓度控制

敏感样本（如神经元、胚胎细胞）：1-2 μM 孵育 10 分钟，避免高浓度（＞5 μM）导致的非特异性荧光；

常规细胞（如 HeLa、HUVEC）：2-5 μM 孵育 15-20 分钟，确保线粒体信号清晰。

避免膜电位干扰因素

实验需避免使用影响膜电位的试剂（如缬氨霉素、FCCP），若需验证膜电位特异性，可设置 FCCP 处理组（膜电位完全丧失，荧光消失）作为阳性对照。

成像参数设置

荧光显微镜：546 nm 激光激发，570-590 nm 发射滤光片；共聚焦显微镜选择 561 nm 激光，585/40 nm 带通滤光片，激光强度控制在 15-25%（避免强光损伤线粒体）。

总结

4-Di-1-ASP 凭借 “线粒体高靶向性 + 红色荧光低干扰 + 低毒性” 的核心优势，成为活细胞线粒体研究的高效工具，尤其适合神经细胞等敏感样本、长时间动态成像及多色实验联用。相比绿色探针，其背景更低、穿透性更强；相比同类红色探针，其对神经细胞的兼容性更优，是神经生物学、细胞凋亡、发育生物学等领域的理想选择。

本文引用地址：https://www.med-life.cn/product/1296512.html

联系方式：4006087598