壬基吖啶橙（NAO，远红外） 属于吖啶橙的衍生物，是一种用于检测完整细胞内线粒体的特异性荧光标记物。壬基吖啶橙（NAO，远红外）与 Rhodamine 123 相比，与内膜的结合不依赖于线粒体膜电位的改变，壬基吖啶橙（NAO，远红外） 更侧重于检测线粒体的变化，在线粒体内可以长期保留，而 Rhodamine 123 是侧重细胞线粒体活性变化，因此，壬基吖啶橙（NAO，远红外） 可以用于细胞分离或者细胞融合后跟踪线粒体的情况，也能对线粒体进行定位研究以及监测线粒体的完整性。该染料还能用来在流式细胞仪上分析线粒体，了解多药物抗性，在小鼠胸腺细胞凋亡期间测量线粒体的变化。需要注意的一点是，高浓度的 壬基吖啶橙（NAO，远红外） 是具有毒性的，可以和所有线粒体中的心磷脂结合。

一、核心优势：线粒体靶向的精准性与功能关联性

双重机制实现线粒体高特异性定位

NAO 分子含亲脂性壬基长链与阳离子吖啶基团：壬基长链通过疏水作用嵌入线粒体膜脂质双分子层，阳离子基团则借助线粒体膜电位（ΔΨm）的静电引力富集于线粒体，定位特异性达 98% 以上，不与内质网、溶酶体等其他细胞器交叉染色（脱靶率＜2%）。

与传统线粒体探针（如 MitoTracker Red）相比，NAO 还能特异性结合线粒体膜中的心磷脂（一种线粒体特有磷脂，占内膜磷脂总量的 20%），这种 “膜电位 + 心磷脂” 双重结合机制，使其在膜电位轻微下降时仍能维持线粒体定位，适合线粒体膜成分与功能的关联研究。

荧光信号稳定，抗光漂白能力强

激发 / 发射波长约 630/650 nm（远红外波段），荧光量子产率达 0.65，低浓度（50-200 nM）即可实现清晰标记，且抗光漂白能力优异：共聚焦显微镜连续扫描 60 分钟，荧光衰减率＜15%（MitoTracker Red 约 30%），适合长时间延时成像（如 24 小时内线粒体融合与分裂的动态追踪）。

二、远红外光谱的独特优势：低干扰与深层成像

极低生物背景，信噪比突破新高

远红外光（650 nm 发射）远离细胞自发荧光的主要波段（蓝色 / 绿色 / 红色，发射峰＜600 nm），生物组织（如细胞、组织切片）对其自发荧光贡献几乎可忽略（仅为绿色探针的 1/100 以下），在复杂样本（如肿瘤类器官、小鼠组织切片）中，信噪比可达 45:1 以上，远超红色探针（如 MitoBright CMXRos，约 30:1）。

不与血红蛋白、胆红素等生物分子发生显著吸收（这些分子对可见光吸收强，对远红外光吸收弱），避免样本自身成分对荧光信号的干扰，尤其适合血液丰富的组织（如肝脏、心脏）中线粒体的观察。

深层组织穿透，适配复杂样本成像

远红外光在生物组织中的散射和吸收是所有荧光波段中最低的，穿透深度可达 100-200 μm（红色探针约 50-80 μm，绿色探针约 20-30 μm），可穿透 3D 细胞球、类器官核心区域或小鼠薄组织切片（如皮肤、肌肉切片），清晰观察深层细胞的线粒体分布，无需解剖或切片处理即可获取完整线粒体形态信息。

三、活细胞兼容性与功能拓展优势

低毒性，不干扰线粒体功能

工作浓度（50-200 nM）下，对线粒体呼吸链活性（ATP 生成量）、膜电位及细胞活性无显著影响（HeLa 细胞存活率＞95%，线粒体复合物 IV 活性与未标记组一致）。

不诱导氧化应激：探针自身 ROS 生成量＜3%，避免因标记导致的线粒体损伤，适合敏感样本（如神经元、胚胎干细胞）的长期研究（如 72 小时内神经元线粒体动态追踪），且不影响细胞凋亡信号通路（如 Caspase 激活、线粒体膜电位变化）。

功能多样，适配多维度线粒体研究

线粒体形态与动态观察：清晰显示线粒体的管状、网状或碎片化形态，可通过 ImageJ 量化线粒体长度、分支数，分析药物（如紫杉醇）或应激（如缺氧）对线粒体形态的影响（如碎片化程度升高提示细胞凋亡）；

线粒体心磷脂检测：NAO 与心磷脂的特异性结合使其可作为心磷脂探针，通过荧光强度变化反映心磷脂含量（如心肌细胞肥大时，心磷脂含量增加，NAO 荧光增强），或监测心磷脂氧化损伤（如氧化应激导致心磷脂降解，荧光减弱）；

多色实验联用：远红外光谱与可见光谱（蓝、绿、红）完全分离，可与任意可见荧光探针（如 DAPI、FITC、PE）联用，串扰率＜1%，例如 “NAO（线粒体，远红外）+ FITC-Annexin V（凋亡，绿色）+ DAPI（细胞核，蓝色）”，同步观察线粒体形态、凋亡状态与核结构，细胞状态分类更精准。

四、典型应用场景

线粒体形态与功能研究

心肌细胞线粒体动态：NAO 标记心肌细胞，通过延时摄影观察心肌收缩时线粒体的形态变化（如收缩期线粒体变短、舒张期恢复管状），配合钙离子探针（如 Fluo-4），分析线粒体形态与钙信号的关联；

神经退行性疾病模型：在阿尔茨海默病小鼠神经元中，NAO 显示线粒体长度缩短、分支减少，且心磷脂含量降低（荧光强度下降 30%），提示线粒体膜损伤与疾病进展的关联。

深层组织与活体成像

肿瘤类器官线粒体成像：NAO 标记 3D 肿瘤类器官，共聚焦显微镜 Z 轴扫描显示类器官核心区域线粒体仍保持清晰信号，量化核心与边缘细胞的线粒体形态差异（核心细胞线粒体碎片化更显著，提示缺氧损伤）；

小鼠心脏组织成像：NAO 通过尾静脉注射进入小鼠体内，活体荧光成像观察心脏区域远红外荧光，缺血处理后心脏线粒体荧光强度降低，反映线粒体功能损伤，可实时评估心肌缺血程度。

线粒体心磷脂与氧化应激研究

心磷脂氧化损伤检测：H?O?处理肝细胞，NAO 荧光强度随处理时间延长而降低（6 小时后荧光强度仅为初始的 50%），同步检测心磷脂氧化产物（如羟基心磷脂），验证 NAO 荧光与心磷脂损伤的关联性；

药物?；な笛椋杭尤胄牧字；ぜ粒ㄈ绺?Q10）后，NAO 荧光强度恢复至初始的 80%，证明药物可抑制心磷脂氧化，为线粒体?；ひ┪锷秆√峁┲惫壑副?。

五、技术优化与注意事项

染色浓度与时间控制

活细胞标记：50-200 nM NAO 孵育 15-30 分钟，避免高浓度（＞500 nM）导致的非特异性染色或线粒体毒性（如膜电位下降）；

心磷脂检测：建议使用 100 nM 浓度，孵育 20 分钟，确保 NAO 与心磷脂充分结合，染色后用 PBS 洗涤 1-2 次，去除未结合探针，降低背景。

成像参数设置

荧光显微镜：633 nm 激光激发，650-670 nm 发射滤光片，激光强度控制在 15-25%（避免强光损伤线粒体）；

共聚焦成像：选择 1.4 NA 高数值孔径物镜，Z 轴切片厚度 1 μm，重建线粒体三维形态，分析深层细胞线粒体分布差异。

心磷脂特异性验证

实验需设置心磷脂消耗组（如用磷脂酶 A?处理，降解心磷脂）作为阴性对照，通过荧光强度差异验证 NAO 与心磷脂结合的特异性，避免膜电位变化对荧光信号的干扰。

总结

NAO 凭借 “远红外低干扰 + 线粒体双重靶向 + 心磷脂检测能力” 的核心优势，突破了传统线粒体探针 “背景高”“穿透浅”“功能单一” 的局限，可实现深层组织线粒体成像与膜成分关联分析，尤其适合复杂样本线粒体研究、心磷脂功能分析及多色高维度实验。相比可见光谱探针，其在深层成像与低背景上不可替代；相比其他远红外探针，其兼具线粒体靶向与膜成分检测功能，是线粒体生物学、疾病机制研究的高效工具。

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