5(6)-羧基荧光素二乙酸 琥珀酰亚胺酯（5(6)-CFDA SE，绿色）是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞示踪绿色荧光染料，除了流式细胞仪检测细胞增殖外，还可用荧光酶标板定量活细胞数目或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察，用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程。

 5(6)-羧基荧光素二乙酸 琥珀酰亚胺酯（5(6)-CFDA SE，绿色）是二乙酸荧光素 (Fluorescein diacetate，FDA) 的衍生物，具有细胞膜渗透性，本身不具有荧光发光性。当通过被动运输穿透细胞膜进入活细胞后，被胞浆内的酯酶催化生成羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)，可发强烈的绿色荧光，不能穿透细胞膜，能完好地保留在胞内。CFSE 还可自发并不可逆地与细胞内的氨基结合从而偶联到细胞蛋白质上，同时过量且未被偶联的  5(6)-羧基荧光素二乙酸 琥珀酰亚胺酯（5(6)-CFDA SE，绿色） 通过被动扩散回到细胞外培养基内，被后续清洗步骤所清除。经  5(6)-羧基荧光素二乙酸 琥珀酰亚胺酯（5(6)-CFDA SE，绿色） 标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数月，因此非常适用于细胞群落分析。

一、核心优势：共价标记与长效稳定性

SE 基团介导的蛋白共价结合，信号不扩散

5 (6)-CFDA SE 是 5 (6)-CFDA 的衍生物，分子结构中新增琥珀酰亚胺酯（SE）基团。进入活细胞后，首先被酯酶水解去除乙酰甲酯（AM）基团，生成含羧基的荧光素（5 (6)-CF）；随后，羧基与细胞内蛋白的氨基（-NH?）通过 SE 基团发生共价反应，形成稳定的 “荧光素 - 蛋白” 复合物。

与非共价探针（如 Calcein AM、6-CFDA）相比，共价结合使荧光信号完全锚定在细胞内蛋白上，不会因细胞分裂或胞吐作用扩散至胞外，标记稳定性显著提升（荧光可维持 7-14 天，是 6-CFDA 的 3 倍以上）。

荧光随细胞分裂均匀分配，适配增殖追踪

共价结合的荧光素随细胞内蛋白均匀分布，细胞分裂时荧光信号平均分配至两个子细胞，荧光强度减半（母细胞荧光强度为子细胞的 2 倍）。通过荧光强度变化可精准判断细胞分裂次数（如分裂 3 次后荧光强度为初始的 1/8），追踪周期远长于 CFSE（荧光维持时间相近，但 5 (6)-CFDA SE 毒性更低）。

二、光谱特性与实验兼容性优势

高亮度绿色荧光，低背景干扰

激发 / 发射波长约 492/517 nm，与 FITC、Alexa Fluor 488 光谱高度匹配，可直接使用荧光显微镜的 FITC 通道（488 nm 激发）或流式细胞仪的绿色荧光通道检测，无需特殊设备。

荧光量子产率达 0.9，亮度比 Calcein AM 高 5-10%，低浓度（0.1-1 μM）即可实现清晰标记；绿色荧光远离细胞自发荧光（蓝色 / 红色），在复杂样本（如混合免疫细胞群、组织移植样本）中背景噪音低，信噪比可达 35:1 以上。

多色实验灵活联用，无串扰

与红色 / 远红外探针（如 PE、APC、7-AAD）联用时光谱分离度高，串扰率＜2%，可构建 “增殖 + 免疫表型 + 活性” 的多参数检测体系：

5 (6)-CFDA SE（增殖追踪，绿色）+ PE-CD3（T 细胞标记，红色）+ 7-AAD（死细胞，远红外）：分析 CD3+ T 细胞的增殖代数与活性状态；

活体移植实验中，标记供体细胞（绿色）后与宿主组织的红色荧光标记（如 DiI 标记血管）联用，观察供体细胞在宿主内的存活与分布。

三、活细胞兼容性与功能拓展

低毒性，支持长期动态研究

工作浓度（0.1-5 μM）下对细胞活性、增殖及功能无显著影响（如 Jurkat T 细胞存活率＞95%，细胞因子分泌量与未标记组一致）。低浓度标记可避免蛋白过度交联导致的细胞应激，适合 7-14 天的长期追踪（如免疫细胞在体内的增殖分化、干细胞移植后的定植过程）。

适配多场景研究，功能多样

细胞增殖定量：通过流式细胞术检测荧光强度分布，生成增殖峰图（如 G0 期细胞呈单峰，分裂 n 次后呈 n+1 个峰），量化增殖比例与代数（如肿瘤细胞在药物处理后的增殖抑制率）；

活体示踪：标记细胞后移植到动物体内（如小鼠皮下、腹腔），通过活体荧光成像观察细胞的存活时间与迁移路径（如 CAR-T 细胞向肿瘤灶的归巢）；

细胞间相互作用：标记效应细胞（如 T 细胞）与靶细胞（如肿瘤细胞），共培养后通过荧光共定位观察细胞接触与杀伤过程，分析免疫突触形成与增殖状态的关联。

四、典型应用场景

免疫细胞增殖与分化研究

T 细胞增殖分析：0.5 μM 5 (6)-CFDA SE 标记人外周血 T 细胞，经 PHA 刺激后培养 7 天，流式细胞术检测荧光强度分布。未刺激组呈单峰（G0 期），刺激组出现 4-5 个峰（分裂 4-5 次），可量化增殖 T 细胞比例与 IL-2 等细胞因子的分泌关联。

干细胞移植与活体示踪

间充质干细胞（MSC）移植：标记 MSC 后静脉注射到肝纤维化小鼠模型中，通过活体荧光成像追踪 MSC 向肝脏的归巢过程，14 天后仍可检测到肝脏内的绿色荧光信号，解剖后通过免疫组化验证 MSC 的定植与分化（如向肝细胞分化）。

肿瘤细胞增殖与药物筛选

肿瘤细胞药敏实验：标记肺癌 A549 细胞后，加入不同浓度的化疗药物（如顺铂），培养 7 天。通过流式细胞术分析荧光峰型，药物处理组增殖峰数量减少（如仅 1-2 个峰），未处理组出现 3-4 个峰，可计算药物对肿瘤细胞增殖的半数抑制浓度（IC??）。

五、技术优化与注意事项

染色浓度与孵育条件

活细胞标记：0.1-1 μM 5 (6)-CFDA SE 在 37℃、5% CO?条件下孵育 15-30 分钟，避免高浓度（＞5 μM）导致的蛋白过度交联；

敏感细胞（如干细胞、免疫细胞）：建议使用 0.1-0.5 μM 低浓度，孵育时间缩短至 10 分钟，减少毒性影响。

增殖追踪的流式参数设置

使用 488 nm 激光激发，530/30 nm 带通滤光片收集信号；通过 “增殖分析” ?？椋ㄈ?FlowJo 软件）拟合荧光峰，计算分裂次数与增殖细胞比例，需以未分裂细胞（0 代）作为荧光强度参照。

样本保存与成像

标记后的细胞需避光培养，长期追踪可加入抗淬灭剂（如 ProLong Live）；固定样本时使用 4% 多聚甲醛（避免甲醇，防止蛋白变性导致荧光丢失），固定后荧光可维持 1-2 周。

总结

5 (6)-CFDA SE 凭借 “蛋白共价结合 + 长效荧光 + 低毒性” 的核心优势，成为细胞长期增殖追踪与活体示踪的优选探针，尤其适合免疫细胞增殖分析、干细胞移植研究及长期药物筛选。相比非共价探针（如 6-CFDA），其标记稳定性与追踪周期显著提升；相比 CFSE，其对敏感细胞的毒性更低，是跨时间尺度（从数天到两周）细胞研究的高效工具。

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