6-CFDA 是活细胞荧光示踪探针，具有细胞膜通透性，可以加载到细胞进行孵育。6-CFDA 一旦进入细胞，非荧光性的 6-CFDA 由胞内酯酶水解成 6-羧基荧光素 (CF)，产生荧光，这些荧光产物只能积聚在具有完整细胞膜的细胞中，因此，死细胞无完整细胞膜不能被染色。6-CFDA 标记可以通过荧光显微镜或者流式细胞仪来检测细胞。

?一、活细胞特异性标记：酶促激活的核心优势

非荧光前体，胞内激活产荧光

6-CFDA 为非荧光脂溶性前体（分子量≈460 Da），含两个乙酰甲酯（AM）基团，可自由穿透活细胞膜；进入细胞后，被胞质内的酯酶水解为水溶性的 6 - 羧基荧光素（6-CF），发出强绿色荧光（激发 / 发射≈492/517 nm）。

死细胞或细胞膜破损细胞缺乏活性酯酶，无法水解 6-CFDA，因此无荧光信号，活细胞标记特异性达 98% 以上，优于台盼蓝（易因细胞肿胀出现假阳性）。

荧光产物稳定，无胞外扩散

水解后的 6-CF 带负电荷，无法穿透细胞膜扩散至胞外，荧光信号可在活细胞内维持 24-48 小时（比 FDA 的 2-4 小时更持久），抗光漂白能力优于 FITC（光漂白率降低约 25%），适合长时间动态观察（如细胞迁移、分裂追踪）。

二、光谱特性与多场景适配优势

高亮度绿色荧光，低背景干扰

6-CF 的荧光量子产率高达 0.9，亮度比 Calcein AM 高 10-15%，低浓度（0.1-1 μM）即可实现清晰标记，减少染料对细胞的潜在毒性（如对干细胞分化的影响）。

绿色荧光（517 nm 发射）远离细胞自发荧光（多为蓝色 / 红色），在复杂样本（如混合细胞群、组织切片）中背景噪音低，信噪比可达 35:1 以上，活细胞轮廓与细微结构（如伪足、胞间连接）清晰可辨。

多色实验兼容性强，无串扰

与红色 / 远红外探针联用无光谱重叠，串扰率＜2%，可构建 “活细胞 + 功能 + 定位” 的多参数检测体系：

6-CFDA（活细胞，绿色）+ PI（死细胞，红色）+ DAPI（细胞核，蓝色）：同步区分活细胞、凋亡细胞与坏死细胞，量化细胞活性；

流式实验中，可与 PE-CD4（免疫表型）、7-AAD（细胞活性）同时检测，实现 “活细胞分选 + 免疫分型”，分选后活细胞存活率＞95%；

细胞通讯研究中，6-CFDA（供体细胞，绿色）+ DiI（受体细胞，红色）：观察细胞融合或间隙连接介导的荧光传递，分析细胞间通讯效率。

三、活细胞兼容性与功能拓展优势

低毒性，支持长期细胞研究

工作浓度（0.1-5 μM）下对细胞活性、增殖及代谢无显著影响（如 HUVEC 细胞增殖率＞95%，胰岛 β 细胞胰岛素分泌量正常），可用于 72 小时以上的细胞增殖追踪（如通过荧光强度变化判断细胞分裂次数）。

不干扰细胞信号通路（如钙信号、MAPK 通路），适合研究细胞生理状态下的动态变化（如缺氧、营养缺乏对细胞活性的影响）。

功能多样，适配多类实验需求

活细胞分?。?-CFDA 标记目标细胞后，通过流式细胞术分选，纯度可达 98% 以上，适合稀有细胞群（如肿瘤干细胞、循环肿瘤细胞）的富集与后续研究（如单细胞测序）；

细胞增殖追踪：细胞分裂时，6-CF 荧光均匀分配至子细胞，荧光强度随分裂次数减半，可通过荧光强度分布判断细胞增殖代数（如 G0/G1 期细胞呈单峰，分裂 2 次后呈 3 个峰）；

细胞迁移与侵袭：标记成纤维细胞或肿瘤细胞后，通过划痕实验或 Transwell 实验，追踪细胞迁移路径与侵袭能力，荧光信号随细胞移动同步延伸，无脱附现象。

四、典型应用场景

活细胞分选与稀有细胞富集

循环肿瘤细胞（CTCs）检测：6-CFDA 标记外周血中的活细胞，结合 EpCAM-PE 抗体（肿瘤细胞标志物），通过流式细胞术分选 CTCs，排除死细胞与血细胞干扰，分选后 CTCs 存活率＞90%，可用于后续基因突变检测。

细胞增殖与活力分析

干细胞增殖追踪：6-CFDA 标记间充质干细胞，通过流式细胞术检测荧光强度分布，分析不同培养条件下干细胞的增殖代数（如第 3 代细胞荧光强度为第 0 代的 1/8），评估干细胞扩增效率。

药物毒性筛选：96 孔板中加入 6-CFDA 与候选药物，通过荧光强度定量活细胞比例，计算 IC??，比 MTT 法更灵敏（检测下限低 10 倍），且可实现高通量检测（1 天内完成 384 孔板分析）。

细胞迁移与通讯研究

划痕实验：6-CFDA 标记成纤维细胞，延时摄影观察活细胞迁移时的伪足伸展与细胞间隙闭合过程，通过 ImageJ 量化迁移速度与覆盖率，分析 EGF 等因子对迁移的调控作用。

间隙连接通讯检测：标记供体细胞（6-CFDA，绿色）与受体细胞（DiI，红色），共培养后观察受体细胞是否出现绿色荧光，判断间隙连接介导的荧光传递效率，研究肿瘤细胞或心肌细胞的通讯功能。

五、技术优化与注意事项

浓度与孵育时间控制

活细胞标记：0.1-1 μM 6-CFDA 孵育 15-30 分钟，避免高浓度（＞5 μM）导致的荧光饱和或细胞毒性；

增殖追踪：选择 0.5 μM 浓度，确保首次分裂后荧光强度减半，峰型清晰（高浓度易导致峰型重叠）。

避免酯酶干扰

染色需使用无血清培养基或含低浓度血清（＜2%）的缓冲液，血清中的酯酶可能提前水解 6-CFDA，导致背景荧光升高；

染色后用 PBS 洗涤 1-2 次，去除胞外未水解的前体，降低背景（尤其在流式实验中，背景降低可提升分选纯度）。

成像与检测参数

荧光显微镜选择 488 nm 激光激发，515-530 nm 发射滤光片；流式细胞术使用 488 nm 激光，530/30 nm 带通滤光片，避免与 GFP 等绿色荧光蛋白串扰（可通过补偿设置进一步优化）。

总结

6-CFDA 凭借 “酶促激活的活细胞特异性 + 高水溶性荧光产物 + 低毒性 + 增殖追踪能力” 的核心优势，成为活细胞研究的多功能工具，尤其适合活细胞分选、长期增殖追踪及高通量毒性筛选。相比 Calcein AM，其荧光产物无钙依赖性聚集，增殖追踪的峰型更清晰；相比 FDA，其荧光稳定性与毒性优势更显著，是细胞生物学、免疫学及药理学研究的高效探针。

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