钙黄绿素 AM（Calcein AM，绿色） 是一种对活细胞进行绿色荧光(Ex：490 nm，Em：515 nm)标记的细胞染色试剂。在传统的 Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯 (AM) 基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。钙黄绿素 AM（Calcein AM，绿色） 本身不发荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。由于死细胞缺乏酯酶， 仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。与其它同类试剂（如BCECF-AM 和 CFDA）相比 钙黄绿素 AM（Calcein AM，绿色）细胞毒性极低，不会抑制任何的细胞功能，如细胞增殖和淋巴球的趋化性等，是最适合用于活细胞染色的荧光探针。

作为核染色染料的碘化丙啶不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光 (Ex：535 nm，Em：617 nm)，因此 PI 仅对死细胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用 545 nm 激发，仅可观察到死细胞。

一、活细胞特异性标记：酶促激活机制的核心优势

细胞内酯酶依赖的荧光激活

Calcein AM 为非荧光前体（分子量≈623 Da），含亲脂性乙酰甲酯（AM）基团，可自由穿透活细胞膜；进入细胞后，被胞质内的酯酶（如羧酸酯酶）水解为水溶性的荧光钙黄绿素（Calcein），发出强绿色荧光（激发 / 发射≈494/517 nm）。

死细胞或细胞膜破损细胞缺乏活性酯酶，无法水解 Calcein AM，因此无荧光信号，实现活细胞的 “特异性标记”，区分效率优于台盼蓝（台盼蓝易被活细胞少量摄取导致假阳性）。

荧光信号稳定，无胞外扩散

水解后的钙黄绿素带负电荷，无法穿透细胞膜扩散至胞外，荧光信号可在活细胞内维持 24-48 小时（固定细胞中可维持数天），抗光漂白能力优于 FITC（光漂白率降低约 30%），适合长时间动态成像（如细胞迁移、增殖的时序观察）。

二、高亮度荧光与光谱兼容性优势

高亮度与低背景，信噪比优异

钙黄绿素的荧光量子产率高达 0.6，亮度比 Hoechst 33342 高 5-10 倍，在低浓度（0.5-2 μM）下即可实现清晰标记，减少染料对细胞的潜在毒性。

绿色荧光（517 nm 发射）远离细胞自发荧光（多为蓝色 / 红色），在复杂样本（如混合细胞群、组织切片）中背景噪音低，信噪比可达 30:1 以上，活细胞轮廓清晰可辨（如神经元的轴突、树突，上皮细胞的紧密连接）。

多色实验灵活联用，无串扰

与红色 / 远红外死细胞染料（如 PI、EthD-I）、细胞核染料（如 Hoechst 33342）联用时，光谱分离度高，串扰率＜2%，可构建 “活细胞 + 死细胞 + 核定位” 的三重标记体系：

Calcein AM（活细胞，绿色）+ PI（死细胞，红色）+ DAPI（细胞核，蓝色）：同步区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡 / 坏死细胞，量化细胞毒性（如药物处理后的活细胞比例）；

流式实验中，可与 PE-CD3（免疫表型）、7-AAD（细胞活性）同时检测，实现 “活细胞分选 + 免疫分型”，活细胞纯度可达 98% 以上。

三、活细胞兼容性与操作优势

低毒性，支持长期活细胞观察

工作浓度（0.5-5 μM）下对细胞活性、增殖及功能无显著影响（如 HeLa 细胞存活率＞95%，心肌细胞收缩频率正常），可用于 72 小时以上的长期动态追踪（如干细胞分化过程中的活性变化、肿瘤细胞体外侵袭的活细胞示踪）。

不影响细胞代谢与信号通路（如钙信号、MAPK 通路），适合研究细胞生理状态下的活性变化（如缺氧、营养缺乏对细胞活性的影响）。

操作简便，样本普适性广

无需复杂预处理：直接加入培养基或缓冲液（如 PBS、HBSS），37℃孵育 15-30 分钟即可完成标记，比免疫荧光标记节省 2-3 小时，适合高通量实验（如 96 孔板细胞毒性筛选）；

适配多种样本类型：可标记贴壁细胞（如上皮细胞、内皮细胞）、悬浮细胞（如免疫细胞、血细胞）、3D 细胞球（如肿瘤类器官）及组织切片（如活组织切片的细胞活性检测）。

四、典型应用场景

细胞毒性与药物筛选

高通量药物毒性检测：96 孔板中加入 Calcein AM 与候选药物，通过荧光强度定量活细胞比例，计算 IC??（半数抑制浓度），比 MTT 法更灵敏、更快速（检测时间缩短至 2 小时）；

纳米材料毒性评估：标记暴露于纳米颗粒（如量子点、金纳米粒）的细胞，通过荧光分布观察纳米材料对细胞膜完整性的影响，判断毒性机制（如膜损伤 vs. 胞内毒性）。

活细胞示踪与迁移

划痕实验：Calcein AM 标记成纤维细胞，延时摄影观察活细胞迁移时的伪足伸展、细胞连接形成，量化迁移速度与覆盖率；

活体移植示踪：标记间充质干细胞后移植到小鼠损伤部位（如皮肤伤口、心肌缺血区），通过活体荧光成像观察干细胞的存活时间与归巢效率。

细胞活性与凋亡分析

双染法区分细胞状态：Calcein AM（活细胞，绿色）+ PI（死细胞，红色）共染，荧光显微镜下直接计数活 / 死细胞比例，或通过流式细胞术量化凋亡率（如化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡）；

3D 类器官活性检测：标记肿瘤类器官，通过共聚焦显微镜观察类器官内部活细胞分布，评估类器官活力（如中心坏死区域的大小与药物处理的关联）。

细胞间相互作用

免疫细胞杀伤实验：Calcein AM 标记靶细胞（如肿瘤细胞），与效应 T 细胞共培养，通过靶细胞荧光强度降低量化杀伤效率，分析 T 细胞的细胞毒性；

细胞融合实验：分别用 Calcein AM（绿色）和 DiI（红色）标记两种活细胞，观察融合过程中荧光的混合，判断融合效率与膜融合动态。

五、技术优化与注意事项

浓度与孵育时间控制

活细胞标记：0.5-2 μM Calcein AM 孵育 15-30 分钟，避免高浓度（＞5 μM）导致的荧光饱和或细胞毒性；

3D 类器官 / 厚组织：2-5 μM 延长孵育至 1 小时，确保染料充分渗透至内部细胞。

避免酯酶干扰

实验需使用无血清培养基或含低浓度血清（＜2%）的缓冲液，血清中的酯酶可能提前水解 Calcein AM，导致背景荧光升高；

染色后用 PBS 洗涤 1-2 次，去除胞外未水解的前体，降低背景。

成像与检测参数

荧光显微镜选择 488 nm 激光激发，515-530 nm 发射滤光片；流式细胞术使用 488 nm 激光，530/30 nm 带通滤光片，避免与其他绿色荧光探针（如 GFP）串扰。

总结

Calcein AM 凭借 “酶促激活的活细胞特异性 + 高亮度绿色荧光 + 低毒性” 的核心优势，成为活细胞标记与活性分析的金标准工具，尤其适合高通量药物筛选、长期活细胞示踪及多色细胞状态分析。相比功能单一的活细胞染料（如 FDA），其荧光稳定性与兼容性更优，是细胞生物学、药理学、毒理学研究中不可或缺的基础探针。

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