DiD 细胞膜荧光探针（红色）染料是亲脂性羰花青类荧光染料家族成员之一，它可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当 DiD 细胞膜荧光探针（红色） 与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。DiD 细胞膜荧光探针（远红色荧光）可以用来对活细胞进行成像和流式分析。DiD 细胞膜荧光探针（红色） 是 DiI 类似物，可以用 633 nm He-Ne 激光器激发，有着比 DiI（一种常见的细胞膜荧光染料）更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。

在固定透化（室温下用 0.1% TritonX-100 透化）后，可以用 DiD 细胞膜荧光探针（红色） 进行质膜染色，也可以在 DiD 细胞膜荧光探针（红色） 染色后可进行多聚甲醛（不可使用甲醇等其他试剂）的固定，但不建议在染色后进行透化。DiD 细胞膜荧光探针（红色） 激发发射光谱图见产品参数。

以每次使用 100 μL 染色工作液，染色工作液浓度 5 μM 计算，10 mg 配置为工作液大概可以用19009 次。

一、细胞膜标记的高稳定性与特异性

双疏水长链锚定，膜结合持久

DiD 分子含两条 C18 饱和疏水长链，可深度嵌入细胞膜脂质双分子层，形成稳定的 “膜 - 染料” 复合物，不依赖膜蛋白或受体，对原核、真核细胞均适用（如细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞）。

标记后仅分布于细胞膜，呈现连续的红色荧光环，内吞率极低（＜0.5%/ 小时），远低于 DiI（＜1%/ 小时）、DiO（＜5%/ 小时），荧光信号可在活细胞中维持 72-96 小时，即使细胞经历多次分裂或长距离迁移（如肿瘤细胞侵袭、胚胎细胞分化），膜荧光仍能均匀分配至子细胞，无明显信号衰减。

低聚集性，细胞边界清晰

DiD 的分子结构对称性更高，在细胞膜中不易发生疏水聚集（聚集率＜1%），避免传统染料 “斑块状” 非特异性染色，可清晰分辨细微膜结构（如上皮细胞的紧密连接、神经元的轴突末梢、免疫细胞的伪足），尤其适合高分辨率成像（如共聚焦显微镜、超分辨显微镜）。

二、红色荧光的光谱优势与多场景适配

长波长优势：低干扰、高穿透

激发 / 发射波长约 644/665 nm，属于红色长波长荧光，远离细胞自发荧光（多为蓝色 / 绿色，发射峰＜600 nm），在复杂样本（如富含脂褐素的衰老细胞、含叶绿素的植物细胞、厚组织切片）中，背景噪音比 DiI（橙红色）降低约 50%，信噪比可达 25:1 以上。

红色光在生物组织中的散射和吸收更少，穿透深度可达 60-100 μm（DiI 约 30-50 μm，DiO 约 10-20 μm），适合 3D 细胞球、肿瘤类器官、动物活体组织（如小鼠皮下肿瘤、脑片）的深层细胞膜成像，可同时捕捉外层与深层细胞的膜形态。

低光毒性，适配光敏感样本

长波长激发光（644 nm）对细胞的光损伤远低于短波长（如 DiO 的 488 nm、DiI 的 549 nm），光毒性降低约 70%，尤其适合对光敏感的样本（如干细胞、神经元、受精卵），可长时间连续成像（如 24 小时延时摄影）而不影响细胞活性与功能（如神经元轴突生长、干细胞分化效率）。

三、多色实验兼容性与功能拓展优势

多色联用无串扰，灵活构建检测体系

红色荧光与绿色（FITC、GFP）、蓝色（DAPI、Hoechst）、远红外（Cy7、APC-Cy7）探针的光谱分离度极高，串扰率＜1%，可同时标记多个靶点：

DiD（细胞膜）+ FITC-Annexin V（凋亡）+ DAPI（细胞核）：同步观察膜形态、凋亡状态与核结构；

DiD（细胞膜）+ GFP - 细胞器标记（如线粒体、内质网）：分析细胞膜与细胞器的空间关联；

流式实验中，可与 PE-CD3（免疫表型）、7-AAD（细胞活性）、Alexa Fluor 488 - 细胞因子（如 IL-2）同时检测，实现 “膜标记 + 免疫分型 + 活性 + 功能因子” 四参数分析，细胞群分群更精准。

荧光共振能量转移（FRET）适配性

DiD 的发射光谱可与远红外染料（如 Cy7）的激发光谱部分重叠，可作为 FRET 供体，用于研究细胞膜上分子间的相互作用（如膜蛋白二聚化、受体 - 配体结合），拓展膜功能研究维度（传统 DiI、DiO 因波长限制，FRET 应用较少）。

四、典型应用场景

深层组织与活体成像

肿瘤研究：DiD 标记肿瘤细胞后接种于小鼠，通过活体荧光成像系统（IVIS）观察肿瘤细胞在体内的迁移与转移（如从原发灶向肺部、肝脏的播散），红色荧光可穿透皮肤与肌肉组织，清晰捕捉转移灶信号；

神经科学：标记脑片深层神经元膜，结合双光子显微镜观察神经元轴突在脑组织中的投射路径（如海马区神经元向皮层的长距离投射），红色光减少组织散射，成像分辨率更高。

光敏感样本的长时程示踪

干细胞研究：标记胚胎干细胞，在低光毒性条件下连续 72 小时追踪其分化过程（如向心肌细胞分化的膜形态变化），不影响分化效率与细胞活性；

受精卵发育：标记斑马鱼受精卵细胞膜，延时摄影观察早期胚胎卵裂过程中的膜分裂动态，红色光避免短波长光对胚胎发育的干扰。

复杂多色实验与膜功能研究

免疫细胞相互作用：DiD 标记 T 细胞膜（红色），FITC 标记树突状细胞膜（绿色），观察免疫突触形成过程中膜接触的动态变化，结合 DAPI 核标记，分析细胞间信号传递的时空关联；

膜蛋白 FRET 研究：DiD 标记细胞膜，Cy7 标记膜受体（如 EGFR），通过 FRET 信号强度变化，量化受体二聚化水平，研究药物对受体激活的调控作用。

五、技术优化与注意事项

染色浓度控制：活细胞推荐 1-3 μM，高浓度（＞5 μM）可能导致膜荧光饱和，影响长时程示踪的定量准确性；固定细胞可提高至 3-5 μM，增强深层组织信号。

长时程成像?；ぃ菏褂煤勾忝鸺恋呐嘌ㄈ?ProLong Live Antifade），减少染料光漂白，延长荧光维持时间至 96 小时以上；低温（4℃）可进一步降低内吞率，适合超长时间静态样本保存。

流式与成像参数设置：流式细胞术使用 633 nm 激光激发，660/20 nm 带通滤光片收集信号；共聚焦显微镜选择 633 nm 激光，650-700 nm 发射滤光片，避免与其他通道串扰。

总结

DiD 凭借 “长波长红色荧光 + 低光毒性 + 高稳定性” 的核心优势，在细胞膜研究中实现了 “深层成像 + 长时程示踪 + 多色兼容” 的多重价值，尤其适合光敏感样本、复杂组织 / 活体成像及高维度多色实验。相比中短波长的 DiI、DiO，其在深层穿透与低损伤性上不可替代，是肿瘤学、神经科学、发育生物学等领域的高效工具。

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