Cell Tracker CM-DiI 细胞膜荧光探针（橙红色）是 DiI 的衍生物，在水中的溶解性优于 DiI。Cell Tracker CM-DiI 细胞膜荧光探针（橙红色） 染料可以自由穿过细胞膜进入细胞，转化为细胞膜不可渗透的反应产物，通过几代培养保留在活细胞中。Cell Tracker CM-DiI 细胞膜荧光探针（橙红色） 染料至少能稳定发出 72 h 的荧光，具有理想的跟踪性能且具有性质稳定、工作浓度无毒性、良好的细胞保留性等优点，在生理 pH 条件下可发出明亮的荧光。此外，Cell Tracker CM-DiI 细胞膜荧光探针（橙红色） 染料的激发和发射光谱与 GFP（绿色荧光蛋白）光谱充分分离，可以多种颜色复用。

Cell Tracker CM-DiI 细胞膜荧光探针（橙红色） 包含一个温和的巯基反应氯甲基取代基，该取代基通过与含巯基的肽和蛋白质共价结合，从而可以与含醛基的固定剂交联，固定后染色信号不会丢失。相比于 DiI 等非共价结合的染料，更适合于固定细胞的染色。

以每次使用 100 μL 染色工作液，染色工作液浓度 5 μM 计算，20 μg 配置为工作液大概可以用 38次，1 mg 配置为工作液大概可以用 1900 次。

一、CM-DiI 的分子设计与标记原理

CM-DiI（1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate）是一种经典的橙红色荧光细胞膜探针，属于羰花青染料家族。其分子结构包含两个 C18 脂肪链和亲水性羧基（CM 基团），激发 / 发射波长约 549/565 nm，发出橙红色荧光。核心优势源于亲脂性锚定、长时程标记稳定性及活细胞兼容性，可实现细胞膜的持续追踪与细胞示踪。

二、细胞膜标记的高效性与持久性

1. 亲脂性插入与膜特异性结合

CM-DiI 的 C18 脂肪链通过疏水作用嵌入细胞膜脂质双分子层，羧基（CM）基团增强水溶性，使其能均匀分布于细胞膜表面，极少进入胞内细胞器。标记后呈现连续的细胞膜荧光环，信噪比达 20:1，适合高分辨率观察细胞边界。

与短链染料（如 DiO）相比，C18 长链显著降低染料内吞速率（内吞率＜1%/ 小时），标记信号可在活细胞中维持 24-72 小时，适合长时间细胞示踪（如干细胞分化谱系追踪）。

2.代谢稳定性与分裂细胞标记

CM-DiI 在细胞内不被代谢降解，细胞分裂时随细胞膜平均分配至子细胞，荧光强度减半，因此可通过荧光强度判断细胞分裂次数（如母细胞荧光强度为子细胞的 2 倍），是细胞增殖示踪的理想工具。

三、橙红色荧光的光谱与应用优势

1. 低自发荧光干扰与多色兼容

橙红色荧光（565 nm）远离细胞自发荧光（蓝色 / 绿色），在组织样本中背景噪音降低约 30%。与 GFP、FITC 等绿色探针联用时，光谱分离度好，例如 “CM-DiI+GFP - 微管蛋白” 同步观察细胞膜与细胞骨架动态，无需复杂光谱补偿。

激发波长 549 nm 兼容 561 nm 黄激光（流式细胞仪）或 TRITC 滤光片组（荧光显微镜），适配常规实验设备。

2.组织穿透性与深层成像

橙红色光在生物组织中的散射少于绿色光，穿透深度可达 30-50 μm，适合 3D 细胞球或厚切片（如胚胎切片）的细胞膜成像，配合共聚焦显微镜可实现细胞边界的三维重建。

四、活细胞示踪与操作便利性

1. 低毒性与长时程动态监测

CM-DiI 工作浓度通常为 1-5 μM，对细胞活性、迁移及分化无显著影响（如神经干细胞标记后分化为神经元的比例与未标记组一致）。可用于活体动物成像（如小鼠皮下注射标记肿瘤细胞，观察转移灶形成）。

标记后不影响膜蛋白功能，适合研究细胞间相互作用（如免疫突触形成）或病毒侵染过程（如 HIV 与细胞膜的融合动态）。

2.操作简便与样本普适性

染色步骤简单：贴壁细胞只需用 1 μM CM-DiI 孵育 10-20 分钟，无需透膜或抗体处理；悬浮细胞可通过离心重悬染色，比免疫荧光标记节省 40% 实验时间。

适用范围广：可标记原核细胞（如细菌）、真核细胞、组织切片及 3D 类器官，甚至可用于植物原生质体的细胞膜标记。

五、典型应用场景

1. 细胞迁移与组织再生研究

伤口愈合实验中，CM-DiI 标记成纤维细胞，通过延时摄影量化迁移速度与方向，结合 DAPI 核标记分析迁移细胞的增殖状态（如 Ki-67 + 细胞的膜动态）。

胚胎发育示踪：斑马鱼胚胎中注射 CM-DiI 标记特定细胞群，观察其在器官形成期的迁移路径（如神经嵴细胞向颅面部迁移）。

2.免疫细胞追踪与肿瘤转移

小鼠肿瘤模型中，CM-DiI 标记 T 细胞（橙红色），通过活体荧光成像监测 T 细胞向肿瘤灶的浸润效率，配合 Luciferase 标记的肿瘤细胞（生物发光），分析免疫治疗效果。

肿瘤细胞转移实验：CM-DiI 标记循环肿瘤细胞（CTCs），流式细胞术检测其膜抗原表达（如 EpCAM）与转移潜能的关联。

3.细胞融合与分裂机制

肌细胞分化过程中，CM-DiI 标记单核肌母细胞，观察其融合形成多核肌管的过程，结合 MyoD-GFP 标记分化状态，研究融合与分化的时序关系。

有丝分裂期细胞膜动态：CM-DiI 标记分裂沟形成与收缩环组装，配合 mCherry - 肌动蛋白，解析胞质分裂的分子机制。

4.病毒与细胞相互作用

流感病毒感染实验中，CM-DiI 标记细胞膜，观察病毒囊膜与细胞膜的融合位点，结合病毒蛋白荧光（如 HA-GFP），量化融合效率与病毒进入路径。

六、技术优化与注意事项

染色浓度与时间控制：活细胞推荐 1-5 μM 孵育 15 分钟，避免高浓度（>10 μM）导致的膜荧光饱和；固定细胞可提高至 5 μM 并延长孵育至 30 分钟，增强信号强度。

内吞抑制策略：若需长时程成像（>24 小时），可在染色后加入胆固醇（10 mM）或低温（15℃）减少染料内吞，维持细胞膜荧光稳定性。

流式细胞术定量：通过 CM-DiI 荧光强度分布评估细胞群的分裂次数，G0/G1 期细胞荧光强度呈单峰，分裂一次后荧光减半形成双峰，适合干细胞克隆效率分析。

总结

CM-DiI 凭借 C18 长链设计、橙红色荧光稳定性及细胞分裂示踪能力，成为细胞膜标记与细胞示踪的金标准工具。其 “持久标记 + 低毒兼容 + 分裂追踪” 的特性，尤其适合需要跨时间尺度（从小时到数天）监测细胞行为的研究，如发育生物学、免疫学及肿瘤转移机制，为动态细胞生物学提供了直观且定量的可视化方案。