PI 细胞周期检测试剂盒（红色） 是一种采用经典的碘化丙啶 (Propidium Iodide，PI) 染色方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。

碘化丙啶是一种双链 DNA 的荧光染料。碘化丙啶和双链 DNA 结合后可以产生荧光并且荧光强度和双链 DNA 的含量成正比。细胞内的 DNA 被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行 DNA 含量测定，然后根据 DNA 含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

碘化丙啶染色后，假设 G0/G1 期细胞的荧光强度为 1 ，那么含有双份基因组 DNA 的 G2/M 期细胞的荧光强度的理论值为 2，正在进行 DNA 复制的 S 期细胞的荧光强度为 1~2 之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生 DNA 片段化 (DNA fragmentation) 导致部分基因组 DNA 片段在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于 1，在流式检测的荧光图上出现所谓的 sub-G1 峰，即凋亡细胞峰。

细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低，因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察细胞凋亡情况。

本试剂盒通常应用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测。如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化成单细胞状态，才可以进行检测。

一、PI 染色的原理与细胞周期检测机制

PI 是一种双链 DNA 嵌入型荧光染料，其染色原理为：

• 细胞膜通透性依赖：正常活细胞的细胞膜完整，PI 无法进入；凋亡或坏死细胞的细胞膜通透性增加，PI 可穿透细胞膜与 DNA 结合；而细胞经固定（如乙醇）或破膜处理后，PI 可进入所有细胞。

• DNA 含量定量：PI 与 DNA 的结合量与 DNA 链长度成正比，在 488 nm 激光激发下发出红色荧光（发射峰约 617 nm），通过流式细胞术检测荧光强度，可对应细胞 DNA 含量（2n/G1 期、4n/G2/M 期、2n~4n/S 期），从而分析细胞周期分布。

二、PI 作为荧光染料的核心优势

1. 高灵敏度与 DNA 结合特异性

   • 精确量化 DNA 含量：PI 与 DNA 的结合常数（K≈10^6 M?1）高于同类染料（如 DAPI），对低拷贝 DNA（如 G1 期 2n DNA）的检测下限达 10^4 bp，流式细胞术可区分 G1 期与 S 期细胞的 DNA 含量差异（如 HeLa 细胞 G1 期荧光强度为 S 期的 50%）。

   • RNA 污染的排除：染色时通常加入 RNase A（50 μg/mL）降解 RNA，避免 PI 与 RNA 非特异性结合导致的荧光偏差（未处理组 RNA 结合可使荧光强度高估 20%~30%）。

2. 多参数分析兼容性

   • 与其他荧光探针联用：PI 的红色荧光（617 nm）与绿色荧光探针（如 Annexin V-FITC 检测凋亡）、蓝色荧光探针（如 Hoechst 33342 标记活细胞）的光谱重叠少，可通过流式细胞术同时检测 “细胞周期 + 凋亡”（如 PI+Annexin V 双染区分 G1 期凋亡细胞与 S 期存活细胞）。

   • 细胞活性同步分析：结合活细胞染料（如 Calcein AM），可在 PI 染色后区分 “活细胞周期” 与 “死细胞周期”（活细胞 Calcein AM 阳性 / PI 阴性，死细胞 Calcein AM 阴性 / PI 阳性），避免死细胞 DNA 降解对周期分析的干扰（如坏死细胞 DNA 碎片化可导致亚 G1 峰假阳性）。

3. 操作简便与成本优势

   • 固定后长期稳定：细胞经 70% 乙醇固定后，可在 4℃保存 1~2 周再进行 PI 染色，适合批量样本处理（如临床活检样本的延迟检测），而活细胞染料（如 Hoechst 33342）需新鲜染色。

   • 价格低廉与广泛适用性：PI 的成本仅为特异性周期蛋白抗体（如 cyclin B1 抗体）的 1/10，且无需抗体孵育、洗涤等复杂步骤，适合高通量筛选（如 96 孔板细胞周期检测，单孔成本＜0.5 元）。

三、应用场景的深度适配

1. 肿瘤细胞增殖与药物筛选

   • 化疗药物作用机制研究：如紫杉醇处理 HeLa 细胞 48 小时后，PI 染色显示 G2/M 期细胞比例从 15% 升至 60%，证明药物阻滞细胞周期于分裂期；结合 IC50 测定，可快速评估药物对细胞增殖的抑制效果（如某抑制剂使 G1 期细胞从 40% 升至 70%，S 期从 35% 降至 10%）。

   • 细胞周期检查点抑制剂开发：在 ATM 激酶抑制剂筛选中，PI 染色可检测 DNA 损伤后 G2/M 期阻滞的解除（如药物处理后 G2/M 期细胞从 50% 降至 20%），配合 γ-H2AX 染色（DNA 损伤标记），验证药物对检查点的抑制活性。

2. 干细胞与再生医学研究

   • 胚胎干细胞分化潜能评估：胚胎干细胞（ESCs）的细胞周期特点为 G1 期极短（约 2 小时），PI 染色显示 G1 期细胞仅占 10%，而分化后成纤维细胞 G1 期占 40%，可通过周期分布变化监测分化进程（如 Oct4 阳性 ESCs 向神经细胞分化时，G1 期比例逐渐升高）。

   • 细胞重编程中的周期调控：在 iPSC 诱导过程中，PI 染色可发现重编程第 5 天出现 S 期细胞激增（从 30% 升至 60%），提示细胞进入快速增殖状态，与克隆形成效率正相关（S 期比例高的克隆形成率达 80%）。

3. 病毒感染与宿主细胞周期互作

   • HIV 感染对 T 细胞周期的影响：HIV 病毒感染 CD4+ T 细胞后，PI 染色显示感染细胞的 G1 期比例从 50% 降至 30%，S 期从 20% 升至 40%，表明病毒诱导宿主细胞进入 DNA 合成期以利于自身复制，配合 p24 抗原染色可验证感染细胞的周期特征。

   • 疱疹病毒复制周期研究：单纯疱疹病毒（HSV）感染后，宿主细胞 G2/M 期比例在 24 小时内从 15% 升至 45%，PI 染色结合病毒衣壳蛋白 VP26 染色（绿色荧光），可定位病毒复制与细胞周期的关联（如 VP26 阳性细胞主要分布于 G2/M 期）。

四、技术优化与注意事项

• PI 染色条件优化：

  • 固定剂选择：70% 乙醇固定适合流式检测（穿透性好），多聚甲醛固定适合免疫荧光共染色（结构保存佳），但需注意多聚甲醛固定后需用 Triton X-100 破膜以允许 PI 进入。

  • 染色浓度控制：PI 工作浓度通常为 50 μg/mL，过高浓度（如 100 μg/mL）可能导致 DNA 聚集，荧光强度饱和（超过流式细胞仪检测范围），建议先做浓度梯度实验（10~100 μg/mL）确定最佳条件。

• 常见问题解决方案：

  • 亚 G1 峰假阳性：坏死细胞 DNA 碎片化会形成亚 G1 峰，可通过 Annexin V+PI 双染区分凋亡（Annexin V+PI-）与坏死（Annexin V+PI+），排除坏死细胞干扰。

  • 细胞聚集体影响：PI 染色前需用 200 目滤网过滤细胞悬液，避免细胞团块导致的荧光强度异常（聚集体荧光强度为单个细胞的 2~5 倍，导致周期分布偏移）。

PI 作为细胞周期检测的经典荧光染料，其核心优势在于通过 DNA 含量的精确量化，实现细胞周期各阶段的快速分型，同时兼容多参数分析与高通量操作。在肿瘤研究、药物筛选及细胞生物学领域，PI 染色法以其高性价比和技术稳定性，成为评估细胞增殖状态的金标准方法之一。尽管存在对活细胞损伤、S 期分辨率有限等不足，但其与其他技术（如 Brdu、周期蛋白抗体）的联合应用，可进一步拓展细胞周期分析的深度与广度，为基础研究与临床应用提供可靠的技术支持。

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